[发明专利]肠道类器官的培养方法及其在肠道毒性测试中的应用

权利要求书

1.一种肠道类器官的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)小鼠肠道隐窝分离：取小鼠的空肠段，去除肠系膜和脂肪后，将肠组织纵向剖开，冲洗并刮去肠绒毛，将肠组织剪成2-5mm长的组织碎片后转移至离心管中，用冷PBS溶液冲洗干净，加入含EDTA的冷PBS溶液解离组织，摇床孵育后弃上清液；加入含BSA的冷PBS溶液，剧烈振荡，使隐窝从组织中释放，取上清液并使用滤网过滤，收集滤液，重复加入含BSA的冷PBS溶液并振荡和过滤，直至滤液中95％以上的细胞粒径小于30μm且滤液中单细胞颗粒与隐窝细胞的数量比小于10:1时，该滤液作为后续隐窝细胞计数及接种的馏分；

2)肠道类器官的培养：将所述馏分离心，弃上清，加入冷DMEM/F12培养基重悬，离心，重复一次重悬操作，进行细胞计数并调整至适宜接种密度，离心，弃上清，加入Matrigel重悬细胞进行重悬并接种，接种密度为20-30个/μL，待基质胶充分凝固后加入类器官完全培养基，进行肠道类器官的培养。

2.根据权利要求1所述的肠道类器官的培养方法，其特征在于：所述滤网的孔径为40-70μm。

3.根据权利要求1所述的肠道类器官的培养方法，其特征在于：所述含EDTA的冷PBS溶液中，EDTA的浓度为2mM；所述含BSA的冷PBS溶液中，BSA的浓度为0.1％质量百分含量。

4.根据权利要求1所述的肠道类器官的培养方法，其特征在于：所述DMEM/F12培养基包含2mM GlutaMax、10mM HEPES、100U/mL双抗和100U/mL两性霉素；所述类器官完全培养基的组分包括：2mM GlutaMax、10mM HEPES、100U/mL双抗、100U/mL两性霉素、N2 supplement(1×)、B27 supplement(1×)、1mM N-乙酰半胱氨酸、50ng/mL EGF、100ng/mL Noggin和500ng/mLl R-spondin-1。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的培养方法培养得到的肠道类器官在肠道毒性测试中的应用。

6.根据权利要求5所述的肠道类器官在肠道毒性测试中的应用，其特征在于：所述肠道毒性为重金属肠道毒性，所述重金属包括：铬、铅、镉、砷、铜、锌。

7.一种应用肠道类器官进行肠道毒性测试的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)如权利要求1至4中任一项所述的培养方法培养得到肠道类器官；

2)对所述肠道类器官分别用含有不同浓度重金属的物质处理进行毒性测试，并测定肠道类器官模型毒性损伤指标随重金属作用浓度的变化曲线；

3)基于所述变化曲线获得的剂量-反应关系数据应用马尔科夫链蒙特卡洛模拟算法建立剂量-反应关系曲线，并估算毒性效应改变10％所对应的基准剂量。

8.根据权利要求7所述的应用肠道类器官进行肠道毒性测试的方法，其特征在于：所述重金属包括：铬、铅、镉、砷、铜、锌；不同浓度重金属的范围为0-500μg/L；毒性测试的观测时间分别是重金属暴露后24h、48h、72h、96h。

9.根据权利要求7或8所述的应用肠道类器官进行肠道毒性测试的方法，其特征在于：所述剂量-反应关系曲线的表达式为：a为未染毒水平下的毒性响应，g为Hill系数，dose为重金属浓度，b为模型效力参数，c为贝叶斯-马尔科夫链蒙特卡洛模拟推算出的常数项。

10.根据权利要求7或8所述的应用肠道类器官进行肠道毒性测试的方法，其特征在于：所述毒性损伤指标包括克隆形成率、类器官形成率、演化率、异形指数、细胞活力、分化水平以及屏障损伤中的一种或多种。