[发明专利]肠道类器官的培养方法及其在肠道毒性测试中的应用

说明书

本发明提供肠道类器官的培养方法，包括如下步骤：1)小鼠肠道隐窝分离；2)肠道类器官的培养。本发明属于生物安全检测与评估技术领域，本发明通过对馏分和接种密度确定等进行了明确化质量控制和条件优化，提供一种可克服主观性偏差、提高类器官形成率的肠道类器官的培养方法，并进一步提供肠道类器官在化学物肠道毒性测试中的应用和相应地测试方法。

技术领域

本发明属于生物安全检测与评估技术领域，尤其涉及肠道类器官的培养方法及其在肠道毒性测试中的应用。

背景技术

类器官是衍生于干细胞的体外3D培养物，通过从人体或小鼠组织中分离干细胞(包括：成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞)，并在体外培养系统中依靠水凝胶等基质支撑、人为添加多种细胞因子促进细胞增殖分化进而自发形成。作为一种新的研究模型，类器官能够模拟天然器官结构和功能，重现所代表器官的一些关键细胞类型和组织结构特征，可弥补小鼠模型的不足。

目前，肺脏、胃、肝脏、胰腺、肠道、骨、前列腺、输卵管、子宫内膜、唾液腺、胎盘、乳腺等来源的类器官能够在体外环境中稳定培养，其中应用肠道类器官的研究报道最多。类器官体积微小、是机体内器官或组织的微缩版本，能再现器官的发育过程，帮助理解复杂器官结构与功能的动态变化轨迹。例如，应用类器官进行化学物毒性测试，在类器官水平观察化学物暴露后引起的细胞组分及结构的变化，通过检测培养介质环境中细胞因子捕捉细胞间的信号交流，结合高通量测序技术实现关键毒性通路筛选和预测类器官所代表的器官或个体对化学物的生物应答。

类器官模型被认为是目前最理想的体外毒性测试模型，该模型的应用极大地推进了基于人体器官水平进行化学物毒性机制的研究。然而受到不同研究者在馏分选择等主观判断上偏差的影响，类器官培养成功率不稳定且试验结果的重复性较差。现有技术1(Toshiro Sato,et al.Single Lgr5 stem cell build crypt-villus structures invitro without a mesenchymal niche.Nature.2009.)公布了肠道类器官的构建及稳定培养方法，该技术为后续基于肠类器官研究奠定了基础。研究者1(Semir Beyaz,et al.High-fat diet enhances stemness and tumorigenicity of intestinal progenitor)、研究者2(Alexi A Schoenborn,et al.The enteric microbiota regulates jejunal Panethcell number and function without impacting intestinal stem cells)和研究者3(Toshiro Sato,et al,Long-term expansion of epithelial organoids from humancolon,adenoma,adenocarcinoma,and Barrett's epithelium)沿用了现有技术1中所述方法进行肠类器官构建，类器官成活率分别为30.52％、24.20％、34.65％；研究者4(WenjuanDi,et al.Improvement of intestinal stem cells and barrier function via energyrestriction in middle-aged C57BL/6mice)在现有技术1的基础上进行改进，使用8mMEDTA进行肠组织消化，并对最终接种的细胞馏分进行3次1000g、5min、4℃离心洗涤，该研究中所述类器官成活率有所提高，为62.26％左右；研究者5(Wenjuan Di,et al.Improvementof intestinal stem cells and barrier function via energy restriction inmiddle-aged C57BL/6mice)在现有技术1的基础上进行改进，使用3mM EDTA进行肠组织消化，并对最终接种的细胞馏分进行150g、10min、4℃离心，该研究中所述类器官成活率有所提高，达到61.69％左右；研究者6(Lan Yu et al,Oral administration ofhydroxylated-graphene quantum dots induces intestinal injury accompanying theloss of intestinal stem cells and proliferative progenitor cells)在现有技术1的基础上进行改进，使用温和细胞解离液(GCDR，stem cell，产品号#07174)进行肠组织消化，该研究中所述类器官成活率有所提高，达到60.86％左右。参阅图1A可以发现，不同研究中肠类器官形成率差异显著，且普遍较低。