[发明专利]基于丁基罗丹明B荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法

说明书

本发明涉及CAT活度测定领域，具体涉及一种基于丁基罗丹明B荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，其基于Fenton试剂(H₂O₂/Fe²⁺)作用下的丁基罗丹明B(b‑RhB)荧光猝灭体系完成过氧化氢酶(CAT)活度测定，在Fe²⁺的作用下，b‑RhB遇H₂O₂出现荧光猝灭，基于加酶前后的荧光变化值确定CAT活度。荧光变化△F与CAT活度E(U/mL)在0.0005～0.05 U/mL活度范围内有良好的线性关系：△F=‑1.476+1205E，r=0.9974，检测限最低为2.49×10^‑5 U/mL。本发明操作简便、成本低、条件易控、结果准确，可直接用于人体血清CAT活度分析。

技术领域

本发明涉及CAT活度测定领域，具体涉及一种基于丁基罗丹明B荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法。

背景技术

过氧化氢酶(catalase，CAT)是分解H₂O₂的专一酶，大量存在于人体组织、细胞中，具有重要的防御功能，与人体健康密切相关，测定血清CAT活度广受临床经验工作者重视。以CAT活度测定为题发表的文章不计其数，目前主要集中于滴定法和可见分光光度法等领域。荧光法具有高选择、低检出等优异特性，罗丹明类染料作为荧光探针试剂现多用于生物化学和药物分析，丁基罗丹明B结构中含有C=N基团，在释放荧光的同时，更容易被H₂O₂氧化，出现瞬间荧光猝灭现象。基于此，本发明提出了一种基于Fenton试剂（H₂O₂/Fe²⁺)作用下的荧光猝灭测定CAT活度的新方法。

发明内容

本发明提供的一种基于丁基罗丹明B荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，其基于Fenton试剂作用下的丁基罗丹明B荧光猝灭体系完成过氧化氢酶活度测定，优于罗丹明B荧光静态猝灭法，过程得以简化，稳定性更高，可直接用于人体血清CAT活度分析，无需繁杂的样品加工处理，有效克服血清自身浊度、色度及共存物质的干扰，临床应用前景广阔。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

基于Fenton试剂作用下的荧光猝灭测定CAT活度的方法，在Fe²⁺的作用下，b-RhB遇H₂O₂出现荧光猝灭，基于加酶前后的荧光变化值确定CAT活度。测定时，取人体血清50 μL置于50 mL容量瓶中，加2.50 mL 浓度为1 U/mL 的H₂O₂底液，30 ℃恒温反应16 min，再依次加入3.50 mL b-RhB、2.50 mL HAc-NaAc缓冲液、0.40 mL Fe²⁺溶液，室温反应20 min后定容，静置1 min，在1 cm吸收池中测定590 nm发射波长处荧光强度F，同步测定酶空白体系F₀，CAT活度E (1 mL CAT溶液所消耗H₂O₂物质的量(μmol))由△F确定，其中，△F = F -F₀。

进一步地，酶空白体系F₀通过以下步骤测定：