[发明专利]一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针。所述引物、探针使延伸温度满足Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度，从而有效缩短扩增时间。另外，改进后的long‑ORF1ab降低了PCR反应体系的背景荧光，消除了探针过长导致的猝灭效率降低的问题。此外，通过优化进一步缩短了反转录和变性时间，在不降低检测性能的前提下，将整个PCR检测时间从74min缩短到37min。本发明还涉及包含所述引物和探针的试剂盒和使用所述引物和探针进行检测的方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术及分子诊断领域，特别涉及一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

由于在全球广泛接种SARS-CoV-2疫苗需要相当长的时间，因此对COVID-19感染人群的快速诊断仍然是疫情防控的主要手段。但是现有的检测技术仍难以满足检测需求，特别是在局部地区突发个例时，需要对整个地区进行大规模筛查，寻找潜在的感染者和密切接触者，这就需要现有的检测技术进一步完善，缩短检测时间，提高检测效率。

当前，核酸检测和抗原检测是确诊COVID-19感染的两种主要方法。根据技术原理，核酸检测可分为两类:一类是靶向核酸扩增检测(TNAAT)，主要包括荧光定量逆转录 PCR(RT-qPCR)和等温扩增；另一种是直接核酸检测，无需靶向扩增，如核酸杂交、基因芯片等。大量临床病例的调查数据显示，至少35％的感染者属于无症状感染者。这些无症状个体和早期感染者的病毒载量较低，靶向核酸的扩增检测无疑更有利于诊断。虽然等温扩增已被证明灵敏度高，不需要精密的控温仪器，前景非常广阔，但大多数等温扩增体系由多种酶和引物组成，反应体系复杂，因此技术要求也较高。与等温扩增相比， RT-qPCR技术更加成熟，且普及率较高。医院和第三方检测机构均有成熟的PCR操作人员。因此，RT-qPCR检测仍是现阶段最流行的核酸检测技术。

快速、有效的病毒检测在新冠疫情时期格外重要，它可以追踪密切接触者，延长治疗窗口，支持靶向治疗。由于SARS-CoV-2的不断变异，现有疫苗的实际保护期需要时间去证明，但在此之前，我们需要不断改进现有的检测方法。为了缩短检测时间，研究人员对RT-qPCR反应中的Taq DNA聚合酶进行了大量的改进工作，如提高其反转录活性进行一步检测、进行点突变和修饰以增大其延伸速率，然而到目前为止，Taq DNA聚合酶的活性已经达到很高，想要再通过提高Taq DNA聚合酶活性来缩短检测时间不太可行；也有研究人员通过使用特殊仪器和更小的反应系统来提高温度变化的速率，如液滴数字PCR(ddPCR)，但是这种方式降低了检测的稳定性和通量。

RT-qPCR作为一种高灵敏度、高特异性的检测方法，在临床多种病原体和病毒的检测中发挥了重要作用。RT-qPCR检测包括逆转录和PCR循环扩增两个过程，PCR循环扩增又包括变性、退火和延伸三个过程。现有的核酸检测试剂盒都是将PCR循环扩增步骤中的退火和延伸合二为一，采用两步循环扩增来减少升温和降温的频率，这就需要在引物的退火温度和Taq DNA聚合酶的延伸温度之间取一个平衡。常规方法是将Taq DNA聚合酶的退火延伸温度设置为探针的退火温度－5℃(约60℃)，但是现有这种方法存在以下缺点：Taq DNA聚合酶在工作过程中没有达到最高活性状态，因此扩增速率未达到最高，从而造成检测耗时较长。因此，开发一种使Taq DNA聚合酶能够以更快的延伸速率工作，同时不降低检测稳定性和通量，有效缩短新型冠状病毒检测时间的一种引物、探针、试剂盒颇为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的上述缺陷，提供一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法。

本发明的第一方面提供了一种使Taq DNA聚合酶能够以更快的延伸速率工作，从而缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针；所述引物两端延长，且延长引物采用检测靶基因中的其中一段序列，所述延长引物与基因组模板完全互补配对。