[发明专利]一种iPSC技术诱导分化的多巴胺能神经元中单囊泡储存的分析方法

说明书

本发明公开了一种iPSC技术诱导分化的多巴胺能神经元中单囊泡储存的分析方法。该方法依次包含Nano‑tip微电极的制备、人多能干细胞的复苏与培养、多巴胺能神经元的定向分化和单囊泡检测。本发明中将基于Nano‑tip微电极的单细胞分析技术与iPSC技术诱导的人源性帕金森病疾病模型相结合，构建了单个神经元中单囊泡分析的方法，为帕金森疾病的病理学研究提供一种新的化学视角，为PD和其他神经退行性疾病的新药发现提供了新的平台和途径。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种iPSC技术诱导分化的多巴胺能神经元中单囊泡储存的分析方法。

背景技术

神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统，是产生认知、学习、记忆、情绪、心理活动及控制运动的重要物质基础。神经元是构成神经系统的基本单位，神经元细胞间的信号传递是通过突触囊泡中的神经递质(如多巴胺，乙酰胆碱，谷氨酸，多肽类等)完成的。单个囊泡中神经递质的含量对于信号传导有着重要的影响，与多种神经疾病的发生发展有关。但由于囊泡极其微小(纳米级)，目前仍缺乏高灵敏度高时空分辨率的神经递质分析方法，对于这一过程的调控机制了解甚少。因此，单细胞水平内对囊泡储存情况进行检测，是近些年来神经科学领域面临的一个非常重大的问题。

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的严重危害人类健康的神经退行性疾病，其最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体多巴胺含量显著性减少。目前，导致这一病理改变的原因是否与单囊泡中神经递质储存有关有待确证。因此，建立高灵敏度的神经递质分析方法，对神经元内单囊泡储存情况，从单细胞水平揭示神经元囊泡储存情况与帕金森病发病直接的关系具有重要意义。

单细胞的分析可以从单细胞水平上反映细胞活动的规律，能够更深层次地从分子水平反映生物分子在活细胞中的功能和作用，揭示重要的生物过程和信号传导机制的本质和规律，为探究疾病早期的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。单细胞的分析技术由于发挥关键作用的生物分子含量极低而面临着巨大的挑战。电化学技术因具有灵敏度高、可实现实时监测等优点而被应用于生物系统中单细胞生物过程中重要生物分子的实时定量分析，其中微电极相对于宏观尺寸电极具有更小的尺寸、更强的电流密度，更高的信噪比，更快的传质速度等，非常适合从单细胞水平对生物过程进行快速灵敏地监测。基于微电极的检测方法为神经元之间信号传递规律的研究提供有力的技术支持。

人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)是近些年来发展最迅速的领域，2012年山中伸弥获得诺贝尔奖之后，iPSCs被公认为最重要的科技之一，并受到广泛的关注。以病人体细胞重新编程而来的iPSCs在特定条件下，可定向分化为病人身体任意一种细胞。其最大优势在于它取材于人类体细胞，从而建立病人特异性iPSC从而构建疾病的模型。病人iPSC来源的特定谱系细胞已经广泛用于构建疾病模型、药物筛选等研究。hiPSCs直接诱导定向分化为特种神经元技术的出现，为建立应用分化得到多巴胺能神经元的帕金森病病模型提供了可能。

综上所述，本发明拟基于nano-tip微电极建立一种监测iPSC技术诱导分化的多巴胺能神经元中单囊泡储存情况的测定方法。同时分析正常组，帕金森病模型组和药物干预组的多巴胺能神经元囊泡储存情况的变化，揭示帕金森病可能的发病机理同时筛选潜在的治疗药物。本发明不仅为单细胞水平的单囊泡储存情况提供新思路、新方法，而且对神经科学领域疾病的发病机制研究及药物筛选等研究具有重要理论意义和广泛实用价值。

发明内容