[发明专利]一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株、方法和应用

权利要求书

1.一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，其特征在于：所述菌株是通过在黑曲霉中敲除敲除草酰乙酸水解酶基因oahA，单独或共同强化表达柠檬酸转运蛋白编码基因cexA、单独或共同强化表达葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC、单独或共同强化表达己糖激酶基因hxkA，单独或共同强化表达磷酸果糖激酶基因pfkA、单独或共同强化表达葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA，单独或共同强化表达透明颤菌血红蛋白编码基因vgb而获得的。

2.根据权利要求1所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述柠檬酸胞外转运蛋白基因cexA的DNA序列为SEQ NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQNO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC的DNA序列为SEQ NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述己糖激酶基因hxkA的DNA序列为SEQ NO.7以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.8以及相似性80％以上的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述磷酸果糖激酶基因pfkA的DNA序列为SEQ NO.9以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.10以及相似性80％以上的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA的DNA序列为SEQ NO.11以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.12以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的DNA序列为SEQ NO.13以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5任一项所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株，其特征在于：生产柠檬酸的黑曲霉的出发菌株为黑曲霉S469；

或者，控制基因转录的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和丙酮酸激酶基因启动子PpkiA；

或者，敲除草酰乙酸水解酶编码基因oahA是利用oahA基因上下游同源序列，通过同源重组的方式将oahA基因表达盒从基因组中删除。

7.根据权利要求6所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述oahA基因上下游同源序列片段序列分别为SEQ NO.1以及相似性为70％以上的DNA序列、SEQ NO.2以及相似性为70％以上的DNA序列。

8.如权利要求1至7中任一项所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株在柠檬酸发酵生产中的应用。

9.利用如权利要求1至8任一项所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：步骤如下：

将黑曲霉菌株接种在能够使黑曲霉产孢子的培养基上，在0～45℃条件下培养，直至产生新鲜孢子；

收集孢子，以1×10⁵～2×10⁶个/mL的孢子浓度接种于种子培养基，然后进行种子液的培养，种子液的培养条件是：10～45℃，100～350rpm条件下振荡培养0～30h，得到种子液；

将种子液以0～15％的接种量接种至发酵培养基中，在0～35℃，100～350rpm条件下发酵，即得柠檬酸；

其中，种子培养基的配方是：0％～55％玉米淀粉浊液，0％～10％(NH₄)₂SO₄，溶剂为水；

所述述发酵培养基为：0％～85％玉米淀粉清液，0％～50％玉米淀粉浊液，溶剂为水；

上述百分数均为质量百分数。

10.根据权利要求9所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：所述能够使黑曲霉产孢子的培养基为PDA培养平板。