[发明专利]一种清金益气组合物的检测方法及其指纹图谱构建方法

权利要求书

1.一种清金益气组合物的检测方法，其特征是包括以下步骤：

S1异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵：

a混合对照品溶液制备：精密称取对照品异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵，加甲醇配制成每1mL含有异阿魏酸10.28μg、橙皮苷75.04μg、甘草酸铵41.92μg的溶液；

b清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

c清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺升麻的阴性组合物、清金益气缺陈皮的阴性组合物、清金益气缺甘草的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

d测定清金益气组合物中异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的含量的色谱条件：色谱柱为Agilent 5 TC-C18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm-甘草酸铵、280nm-异阿魏酸、橙皮苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；

e分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d所述色谱条件，测定，即得；

S2戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷：

a′混合对照品溶液的制备：精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷，加甲醇配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷10.00μg、马鞭草苷10.14μg、黄芩苷65.7μg、汉黄芩苷20.04μg的溶液；

b′清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

c′清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺马鞭草的阴性组合物、清金益气缺黄芩的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

d′色谱条件：色谱柱为Agilent 5 TC-C-18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％-12％B；10-15min，12％B；15-55min，12％-40％B；55-60min，40％-90％B；检测波长为237nm-戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、280nm-黄芩苷、汉黄芩苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温:30℃；

e′分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c′获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d′所述色谱条件，测定，即得。

2.一种清金益气组合物的指纹图谱构建方法，其特征是包括以下步骤：

a″混合对照品溶液的制备：分别精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、异阿魏酸、橙皮苷和甘草酸铵，加甲醇，配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷13μg、马鞭草苷13.5μg、黄芩苷150.5μg、汉黄芩苷30μg、异阿魏酸7.4μg、橙皮苷73μg和甘草酸铵15.6μg的溶液；

b″供试品溶液的制备：取至少7批次的清金益气组合物，各0.50g，分别置于具塞锥形瓶中，加入25mL体积浓度为70％的甲醇水溶液，超声，取上清液，得到至少7个供试品溶液；

c″测定：分别精密量取混合对照品溶液和至少7批次供试品溶液各10μL，分别使用高效液相色谱进行检测，色谱柱为Agilent 5 TC-C18，250×4.6mm，5μm；采用梯度洗脱，流动相为A和B组成，A为体积浓度0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，所述梯度洗脱程序如下：0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；得到混合对照品图谱和相应的至少7批次清金益气组合物指纹图谱；

d″将至少7批次清金益气组合物指纹图谱采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据分析，以第1批次的清金益气组合物指纹图谱为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和Mark峰匹配，生成清金益气组合物对照指纹图谱，共标定13个共有峰，与混合对照品图谱比对，指认其中7个色谱峰，分别是1号峰戟叶马鞭草苷、2号峰马鞭草苷、3号峰异阿魏酸、7号峰橙皮苷、8号峰黄芩苷、12号峰汉黄芩苷、13号峰甘草酸铵；以对照指纹图谱为基准，计算至少7批次的清金益气组合物指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。