[发明专利]一种3D打印负载干细胞外泌体的气管支架的制备方法

说明书

本发明涉及一种3D打印负载干细胞外泌体的气管支架的制备方法，包括以下步骤：步骤（1）、骨髓间充质干细胞外泌体提取及鉴定；步骤（2）、3D打印PCL气管支架的制备；步骤（3）、光固化水凝胶负载干细胞外泌体；步骤（4）、负载干细胞外泌体复合气管支架的制备；将步骤（2）打印得到的PCL支架浸泡在负载干细胞外泌体的SilMA溶液Exo‑SilMA中，37℃下浸泡30分钟，之后使用蓝光灯交联5分钟，使Exo‑SilMA均匀包裹PCL支架。通过本发明，PCL支架可以提供良好的力学性能，而SilMA具有良好生物相容性、生物降解性、溶胀作用，能够富集促进组织再生的生物成分，间充质干细胞外泌体作为干细胞衍生物，能够发挥干细胞的修复功能，且避免了移植干细胞的致瘤、排斥等风险。

技术领域

本发明涉及一种3D打印负载干细胞外泌体的气管支架的制备方法，属于气管组织工程支架技术领域。

背景技术

3D生物打印是一种能够生成复杂度类似组织且可精确控制的3D组织构建物的新型技术，它实质上是采用3D打印技术逐层构建材料并生成3D组织构建物的增材制造过程。外泌体是细胞分泌的纳米级脂质体囊泡，其直径在 30‐200nm范围内，其包裹了干细胞的重要功能物质如蛋白质、mRNAs 以及micro RNAs等。移植外泌体既可发挥干细胞的功能又可以避免直接移植干细胞的风险，如致瘤风险、伦理、免疫排异反应、栓塞等，因此，其可能成为组织工程领域中的一项具有前景的生物材料。目前还未有将干细胞外泌体应用于气管支架中的发明，因此，本发明利用3D打印技术，结合光固化水凝胶和聚己内酯（PCL）材料，负载骨髓间充质干细胞来源的外泌体，制备一种新型的复合气管支架，从而构建更加合理有效的气管替代物。

发明内容

本发明的目的针对现有技术中存在的不足，将骨髓间充质干细胞外泌体与气管支架有机结合，构建新型负载干细胞外泌体气管支架，发挥干细胞外泌体促气管组织修复再生的作用，从而提供一种3D打印负载干细胞外泌体的气管支架的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现：一种3D打印负载干细胞外泌体的气管支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）、骨髓间充质干细胞外泌体提取及鉴定；

收集骨髓间充质干细胞培养基的上清液，采用超速离心法提取干细胞外泌体，PBS溶解后，使用0.22μm滤膜过滤除菌，于-80℃保存；应用透射电子显微镜，鉴定提取的外泌体，观察干细胞外泌体的形态并采图；

步骤（2）、3D打印PCL气管支架的制备；

将PCL材料加入至3D打印机打印PCL支架；

步骤（3）、光固化水凝胶负载干细胞外泌体；

选择光固化水凝胶作为外泌体的载体，光固化水凝胶为光固化丝素蛋白，即甲基丙烯酰化丝素蛋白SilMA溶液，之后将经步骤（1）提取到的干细胞外泌体加入至SilMA溶液中，避光4℃保存；

步骤（4）、负载干细胞外泌体复合气管支架的制备；

将步骤（2）打印得到的PCL支架浸泡在负载干细胞外泌体的SilMA溶液Exo-SilMA中，37℃下浸泡30分钟，之后使用蓝光灯交联5分钟，使SilMA溶液Exo-SilMA均匀包裹PCL支架。

步骤（3）中，所述光固化水凝胶也可以选择光固化海藻酸钠、光固化硫酸软骨素、光固化明胶或光固化透明质酸。

步骤（3）中，所述SilMA溶液的制备方法为：

将再生丝素蛋白用溴化锂溶解，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，经透析后冷冻干燥后获得SilMA；使用PBS配置0.4%W/V光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂，将冻干后的SilMA溶解于苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液中得到SilMA溶液。