[发明专利]增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法

说明书

本发明公开了一种增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，是通过在茂原链霉菌C2中，利用强启动子kasOp*分别过量表达调控蛋白基因SMDS_4036、SMDS_2341、SMDS_3961，得到TG酶产量提高的突变株。增强调控蛋白基因的表达可以强化正调控，由此来提高TG酶产量。本发明实施例中所得的工程菌株LX‑55、LX‑56、LX‑58的TG酶发酵终产量较野生菌株分别提高33.33％、16.65％、69.76％。通过本发明可显著提高TG酶的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，尤其涉及一种通过增强正调控基因的表达，强化对谷氨酰胺转氨酶(TG酶)的正调控，提高TG酶发酵水平的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TG酶)是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TG酶是外分泌蛋白，在胞内为pre-pro-MTGase初始形式，穿过细胞膜成为无活性的酶原pro-TGase，经过金属蛋白酶TAMEP切割信号肽成为FRAP-TGase，再经丝氨酸蛋白酶 SM-TAP切割成为最终成熟的TG酶。TG酶作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块，提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TG酶制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等等。在TG酶发酵过程中，茂原链霉菌调控途径并不明确，是工业上限制TG酶产量提高的关键因素。在本发明中，通过亲和层析和质谱鉴定，找到了正调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341和SMDS_3961。过量表达正调控蛋白编码基因可以明显提高TG酶产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。本发明通过过量表达茂原链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因SMDS_4036、 SMDS_2341、SMDS_3961，可以增强对TG酶的正调控，最终可明显提高TG酶产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明涉及一种过表达调控蛋白编码基因以提高TG酶发酵水平的方法，过表达茂原链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341或 SMDS_3961；强化对TG酶的正调控，进而提高TG酶产量。

作为一个实施方案，所述调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341和SMDS_3961的依次序列如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3所示。

作为一个实施方案，所述方法包括如下步骤：

S1、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_4036的整合型质粒载体I；

S2、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_2341的整合型质粒载体II；

S3、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_3961的整合型质粒载体III；

S4、整合型质粒载体I-III分别通过接合转移导入受体菌茂原链霉菌C2中进行位点特异性重组；

S5、通过安普霉素抗性和PCR验证筛选，分别得到基因过量表达的重组突变株。依次记为LX-55、LX-56、LX-58。

作为一个实施方案，所述方法还包括所述重组突变株发酵获得TG酶的步骤。