[发明专利]一种耐酸酿酒酵母及其应用

说明书

本发明公开了一种耐酸酿酒酵母及其应用，属于代谢工程技术领域。本发明以酿酒酵母S288C为出发菌株，敲除酿酒酵母S288C的ROX1转录调控因子中的结构域HMG，或将ROX1转录调控因子中的G158A进行突变，得到所述耐酸酿酒酵母。本发明对ROX1进行了5种不同程度的突变，实验数据表明，当ROX1结构域HMG不同程度的破坏后，同样能达到很好的耐酸效果：pH2.32条件下，与野生型菌株WT相比生长表型(最大ODsubgt;600/subgt;)提高14‑15倍。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，尤其是指一种耐酸酿酒酵母及其应用。

背景技术

酿酒酵母因其生长周期短、发酵能力强、规模化生产性能好等优点，成为微生物发酵生产的主要底盘细胞之一。近年来，研究人员专注于提高酿酒酵母对各种胁迫的耐受性，例如温度、pH值、渗透压(盐类、醇类)等，以提高细胞在不同环境中的耐受性。例如，为了获得能够耐受高温并产生乙醇的酿酒酵母菌株，将具有高乙醇生产力的同型菌株与表现出耐高温表型的异型菌株进行杂交，得到杂交TJ14，该菌株可以合成乙醇在高温下有效。为了增加细胞对乙醇(这是酵母细胞最常见的压力)的耐受性，现已报道的耐受乙醇的机制主要与膜成分的变化，以及稳定或修复变性蛋白质相关。

此外，基于特定环境设计细胞抗逆的能力可能会在基础研究和生物制造中有所应用，而酿酒酵母的耐酸一直受到研究者的高度关注。例如，通过实验室适应性进化获得了能够耐受芳香酸(pH3.5)的菌株，进一步分析表明，芳香酸转运蛋白ESBP6的过表达是提高对低pH耐受性的关键因素。同时，先前的报道表明，质子泵PMA1和PMA2的过表达能够增加酵母的耐酸性，并且Pdr18(ABC转运蛋白)参与酵母对乙酸胁迫的反应。然而，质子泵或其他ABC转运蛋白可以增强菌株的耐酸性，但只能提高对弱酸(pH4.0-5.8)的耐受性。因此，目前酵母的耐酸性还远远不能满足工业生产所形成的较低pH环境的需要。

目前报道的微生物生产有机酸主要是添加中和剂(碳酸钙等)来调节发酵过程的低pH，形成有机酸盐，后续要经过酸解、分离、纯化等繁琐程序。一方面增加了产物分离、纯化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和剂，还会造成资源的浪费和环境的污染。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种耐酸酿酒酵母及其应用。因此，本发明提供新的耐酸机制及构建方法，为耐酸底盘细胞的构建提供理论基础。

本发明的第一个目的在于提供一种耐酸酿酒酵母，以酿酒酵母S288C为出发菌株，敲除酿酒酵母S288C的ROX1转录调控因子中的结构域HMG，或将ROX1转录调控因子中的G158A进行突变，得到所述耐酸酿酒酵母；所述ROX1转录调控因子的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示。

在本发明的一个实施例中，所述G158A突变后的位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一个实施例中，敲除所述ROX1中的8aa-91aa片段、54aa-368aa片段、1aa-53aa片段、1aa-7aa片段或92aa-368aa片段中的一个或多个。

在本发明的一个实施例中，敲除8aa-91aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一个实施例中，敲除54aa-368aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所述。

在本发明的一个实施例中，敲除1aa-53aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。