[发明专利]一种基于16SrRNA扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法

说明书

本发明公开了一种基于16SrRNA扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其包括步骤为：步骤一、构建土壤非冗余致病细菌数据库；步骤二、完成对土壤/植物样品DNA的提取；步骤三、完成样品的16S rRNA基因测序，获得测序下机数据；步骤四、采用DADA2分析流程封装土壤非冗余致病细菌库，获得代表性序列；步骤五、将代表性序列与土壤非冗余致病菌数据库比对注释致病细菌，得到最终的ASV物种表，通过R语言对ASV物种表中不同样品的致病细菌组成、多样性特征等进行可视化作图。本发明能快速、精准检测致病菌，且不易受到样品污染的影响，可而可实现快速、全面、准确检测致病菌的目标。

技术领域

本发明涉及土壤生物学及生物信息学领域，具体是通过构建植物和人畜致病细菌非冗余数据库，针对高通量测序数据比对注释实现土壤-植物生态系统中致病细菌生物污染的精准识别与定量。

背景技术

随着人类活动影响的加剧，集约化的土地利用方式使得土传植物致病菌及人畜共患病原体的种类和数量不断增加，严重威胁农业生产及人类健康。当前对致病菌的检测方法主要有PCR法及基因组分析方法。然而，PCR法虽具有靶向性强、应用广泛的优势，但受限于引物的种类数量且易出现假阳性。此外，基因组测序可精准识别致病菌携带的耐药基因和毒力基因，但其测序价格昂贵且需花费的时间较长。而针对细菌16S rRNA基因的高通量测序具有检测特异度高、测序成本低等优点，可基于较为齐全的Silva数据库进行物种注释。而且该测序方法在生物多样性和群落生态学领域已发表大量研究论文，所获结果具有可靠保障。然而，当前针对致病细菌的检测才刚刚起步。有研究采用探针类方法进行检测，但对操作人员的要求较高、仅能检测307种病原菌。而通过16S扩增子测序方法的仅收集300种临床致病菌建库检测，尚缺乏对土壤-植物生态系统致病细菌进行检测的方法。因此，构建一种基于高通量测序检测土壤致病细菌的新方法，一次性可检测上千种致病菌，为土壤-植物生态系统病原污染的靶向消减及维护全球一体化健康提供重要方法技术，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于16SrRNA扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，通过网络和文献资源手段，获得当前较为齐全的细菌致病菌库，并通过比对最新Silva16S细菌数据库的序列资源，构建了土壤非冗余致病菌数据库用于高通量测序分析，从而实现基于16S rRNA基因测序分析快速准确检测土壤致病细菌丰度及组成特征，为消减土壤-植物生态系统病原污染提供研究技术及策略。

本发明采取的技术方案是：一种基于16SrRNA扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其包括以下步骤：

步骤一、构建土壤非冗余致病细菌数据库；

步骤二、完成对土壤/植物样品DNA的提取；

步骤三、完成样品的16S rRNA基因测序，获得测序下机数据；

步骤四、采用DADA2分析流程封装土壤非冗余致病细菌库，获得代表性序列；DADA2不再以相似度聚类，而是通过降噪得到不含扩增与测序错误且不含嵌合体的生物学序列，聚类准确率优于传统聚类方法。因此，通过将DADA2流程得到的代表性序列与土壤非冗余致病细菌数据库进行比对注释，可精准检测识别样品中的致病细菌丰度及群落多样性特征。

步骤五、将代表性序列与土壤非冗余致病菌数据库比对注释致病细菌，得到最终的ASV物种表。

进一步的，所述步骤二中，通过FastDNA试剂盒完成对土壤/植物样品DNA的提取；所述步骤三中，利用Illumina PE250测序平台完成样品的16S rRNA基因测序。

进一步的，所述步骤四中，采用DADA2流程对测序下机数据进行包括去除接头、质控、降噪、合并双端、去除嵌合体的步骤处理，获取代表性序列。

进一步的，所述步骤五中，通过uclust软件，设置相似度阈值为＝90％，将代表性序列与土壤非冗余致病细菌数据库比对注释致病细菌，得到ASV物种表。