[发明专利]地黄品种遗传关系、种类鉴别用分子标记SSR引物、试剂盒、应用

说明书

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及地黄品种遗传关系、种类鉴别用分子标记SSR引物、试剂盒、应用。采用本发明提供的50对SSR引物分别对黄淮地区17份种植资源的DNA进行扩增，通过聚类分析和遗传相似度分析，明确不同品种之间的衍生关系、遗传差异、演进关系等，能够为育种选育提供科学的依据。同时，采用本发明提供的15对SSR引物，能够通过不同引物对之间扩增产物的差异组合精确区不同的地黄品种，能够实现DNA水平上对17个黄淮产区地黄品种的区分鉴别，构成了其SSR指纹图谱。

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及地黄品种遗传关系、种类鉴别用分子标记SSR引物、试剂盒、应用。

背景技术

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科(scrophulariaceae)地黄属(Rehmanniaceae) 多年生草本植物，其根茎肉质，鲜时呈黄色，因而得名。地黄在我国主要分布在河南、河北、山东、天津、陕西、山西、四川、安徽、以江浙等地区。作为一种传统大宗中药材，地黄具有清热凉血、养阴生津的功效。现代药理学研究表明地黄在提高机体免疫力、抗癌、防癌等方面都具有积极作用。

我国最早地黄栽培品种记载见于一千余年前的《图经本草》，第一个近代地黄品种是崔大毛1917年选育的四齿毛，李开寿随后培育的金状元在很长一段时间内都是国内的主栽品种，同一时期较为著名的农家品种还有小黑英、郭里锚、邢疙瘩等。建国后，来自中国医学科学院药用植物所、河南温县农科所等单位选育出了以北京1号、北京3号和85-5 系列的现代地黄品种，这些现代品种在生产中逐渐取代了早期的农家种，开始占据地黄生产中的主导地位。但是随着审定品种数量的增多，特别是通过无性突变选育的品种大量出现，使得地黄品种的遗传基础狭窄、亲本材料来源单一、形态相似度高等问题开始凸显。品种验真、资源鉴定仍靠形态学差异和简单的理化测定，传统的表型特征区分品种受环境影响大，且性状鉴定易受主观影响，准确度不高，对于亲缘关系较近的品种鉴别能力差，严重限制了地黄遗传改良和品种更新。同时，缺乏有效的分子鉴定手段还将导致外形相似的品种在生产中难以提纯、去杂，导致药材产量和质量产生较大的波动，制约了地黄功效发挥。因此，了解不同品种地黄的亲缘关系，开发有效的分子鉴定方法区分栽培品种，丰富地黄优良性状是目前迫切需要解决的问题。

为克服品种间表型区分难题，分子标记被逐渐被应用于地黄的多样性分析和亲缘聚类研究。地黄作为我国传统中药材，拥有深厚的栽培和药用历史积淀。但其研究基础相比大田作物及其它模式植物，则明显滞后，目前地黄品种的分子鉴定研究基本以RAPD、AFLP、SRAP及ISSR引物为主。1997年，Choi首次使用RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)标记技术对愈伤组织产生的地黄单株进行遗传多样性分析；Hatano在一年也使用 RAPD标记技术对茎尖快繁的地黄品种和Fl代杂种的遗传背景进行了检测；陈京荔等利用20个RAPD引物将19个地黄品种按照亲缘关系划分成4个亚类；Yuan等用AFLP (Amplified fragmentlength polymorphism)分析新加坡市场上销售的地黄基因型与有效成份的关系；周延清等首先对怀地黄ISSR(inter-simple sequence repeat)扩增的体系进行了优化，然后利用RAPD与ISSR技术对8个品种地黄和2个脱毒品系进行了遗传多样性分析；利用同样的引物组合，周延清等还对怀地黄“85-5”品种的16个单株的遗传多样性进行分析；吴志刚等利用RAPD对16个栽培地黄品种、2个野生居群进行了亲缘关系和遗传特点分析。。石海霞等采用10对SRAP标记对21个地黄种植进行遗传多样性分析，发现地黄种质遗传多样性水平为中等偏低水平；赵楠等使用ISSR标记分析了地黄居群间的基因流和进化关系。