[发明专利]一种可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）通过网址http://genome.ucsc.edu/检索斑马鱼法尼醇X受体基因调控序列，斑马鱼法尼醇X受体基因调控序列的名称为nr1h4，利用Promoter 2.0软件对上述调控序列nr1h4进行优化，设计并合成引物；

（2）以斑马鱼基因组为模板，加入上述设计合成的引物，利用PCR方法钓取斑马鱼nr1h4调控序列，钓取获得的斑马鱼nr1h4调控序列如SEQ ID NO:1所示；

（3）将钓取的斑马鱼nr1h4调控序列通过酶切连接构建于pT2AL200R150G转座载体克隆位点，获得转座质粒pTol2-nr1h4-EGFP；

（4）将转座质粒pTol2-nr1h4-EGFP与pCS-TP转座酶mRNA共同注入野生型斑马鱼受精卵单细胞，孵化培养后，在荧光显微镜下筛选出在肝脏和肠道中特异性表达的荧光个体为F0代；所述荧光个体为阳性个体，即可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型；

（5）将上述F0代阳性个体与野生型斑马鱼杂交，筛选出F1代阳性个体；将F1代阳性个体再与野生型斑马鱼杂交，筛选出F2代阳性个体；在F2代阳性个体间进行杂交，筛选出阳性个体，再通过三代遗传筛选，即获得稳定遗传的可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型Tg（-1.6nr1h4-EGFP）。

2.根据权利要求1所述可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型的构建方法，其特征在于，所述引物为：

上游引物:5'- CGCGGATCCTGCAGCATCATGCTTGTGGAAG-3'；

下游引物: 5'-CCGCTCGAGTCATCGTGTGAACCACAATGCTC-3'。

3.权利要求1所述构建方法获得的可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型在评价调节胆汁酸代谢的药物效果上的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）在育有可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型幼鱼的培养液中，加入黑色素合成抑制剂，再分为加药组和对照组，在加药组加入待评价的调节胆汁酸代谢的药物，继续培养1天-4天；

（2）在荧光显微镜下观察上述模型的斑马鱼的肝脏及肠道荧光情况，如果加药组的荧光强度比对照组增强，则判定该调节胆汁酸代谢的药物有效。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述黑色素合成抑制剂为10-50mg/L的1-苯基-2-硫脲或30%的双氧水。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在观察前将斑马鱼麻醉。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型幼鱼的鱼龄在加药时为受精卵孵化后的第4天-10天。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荧光强度比对照组增强是指：荧光强度比对照组增强5%以上。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述麻醉斑马鱼的麻醉剂包括三卡因或巴比妥类麻醉剂。