[发明专利]一种乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体及其在提高乳酸的合成中的应用，该突变体是乳酸脱氢酶LdhA蛋白的第9位赖氨酸突变为精氨酸形成的，命名为K9R突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种乙酰化调控的乳酸脱氢酶双突变体及其在抑制乳酸的合成中的应用，该突变体是乳酸脱氢酶LdhA蛋白的第154位和248位的赖氨酸突变为谷氨酰胺形成的，命名为K154Q‑K248Q双突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。实验证实K9R突变体使得LdhA的酶活提高了2.5倍，过表达K9R突变体的菌株乳酸产量比过表达野生型LdhA提高1.67倍；K154Q‑248Q双突变体的活性降低至野生型的12.6％，基因组上ldhA基因原位突变为K154Q‑K248Q的双突变菌株在抑制乳酸合成方面可以实现与目前常用的ldhA基因敲除法类似的效果。

技术领域

本发明涉及一种乳酸脱氢酶突变体及其应用，尤其涉及一种乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体及其应用。属于基因工程技术领域。

背景技术

乳酸是一种重要的大宗化学品，常用于食品的调味剂和防腐保鲜剂。乳酸也是一种刺激性甚微的天然保湿成分，应用于各类化妆品中。在医药方面，乳酸被广泛用作防腐剂、载体剂、助溶剂、药物制剂、pH调节剂等。同时，乳酸还可以作为单体合成聚乳酸，是一种新型的生物可降解塑料。因此，乳酸在食品、化妆品、医药、农业、化工、可降解塑料等领域均具有广泛的应用。目前，乳酸的合成方法主要包括微生物发酵法和化学合成法。其中微生物发酵法因其绿色环保、原料可持续等优势成为乳酸合成的主要方法。

NAD依赖的乳酸脱氢酶(LdhA)是一种广泛存在于各类物种的保守酶，特异性催化丙酮酸转化为乳酸。在微生物合成乳酸的工程菌中，经常通过过表达乳酸脱氢酶LdhA实现乳酸产量的提升。然而LdhA的天然酶活性限制了乳酸的合成效率。优化LdhA的催化活性成为进一步提升乳酸产量和转化效率的重要方法。

另外，在其他生物基化学品的合成过程中，乳酸也是一种重要的副产物。当底物的快速消耗和有限的细胞呼吸能力不平衡时，导致丙酮酸和NADH大量积累，LdhA催化丙酮酸转化为乳酸。乳酸的合成会浪费目标产物合成途径的碳源，影响目标产物的产量和转化效率。在其他生物基化学品的合成过程中为避免乳酸副产物的合成，常用的方法是直接敲除基因组上的ldhA基因。ldhA基因的直接敲除虽然会抑制乳酸的产生，但同时也影响了生物量的积累。因此探索一种新的代谢调控方法，在维持细胞正常生物量积累的前体下抑制乳酸副产物的合成，有望解决目前微生物合成过程中乳酸副产物积累的共性问题。

赖氨酸乙酰化修饰是一种保守的翻译后修饰机制，影响酶的活性、代谢流分配、复制转录等多种细胞生理和代谢过程。然而，目前赖氨酸乙酰化修饰在细菌乳酸脱氢酶LdhA的活性和乳酸合成调控中的作用暂无报道。进一步的，有关通过调控乳酸脱氢酶的赖氨酸乙酰化修饰，改变乳酸脱氢酶的活性，实现乳酸合成调控的方法，以及相关乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体及其应用也还未见报道。

发明内容

针对乳酸作为目标产物的微生物合成过程中，其乳酸脱氢酶LdhA的天然活性限制问题，以及在其他生物基化学品合成过程中，乳酸作为副产物积累的问题，本发明的目的是提供一种乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体及其应用。通过调控乳酸脱氢酶LdhA的特定赖氨酸乙酰化位点，依据合成需求提高或降低乳酸脱氢酶的活性，实现对乳酸的合成调控。

本发明所述的乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体是乳酸脱氢酶LdhA蛋白的第9位赖氨酸突变为精氨酸形成的，命名为K9R突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明所述乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体在提高乳酸的合成中的应用。

本发明提供了一种上述乙酰化调控的乳酸脱氢酶K9R突变体的表达菌株，其特征在于：所述菌株中携带如SEQ ID NO.3所示的K9R突变的乳酸脱氢酶基因ldhA。