[发明专利]一种检测细胞DNA含量的方法及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种引物和探针组合物、同时检测细胞DNA片段含量和大小分布的检测方法及其试剂盒，包括3套引物和探针，检测反应优化设置了40µL定量PCR反应体系，反应程序中退火延伸温度为60℃，3套引物和探针单独单管检测同一样本的小、中、大3类DNA片段，灵敏度可达0.003pg/µL，有效避免了假阳性反应、特异性高，还可以同时分析MDCK细胞的大小分布，远远高于常规的标准要求。

技术领域

本发明涉及核酸的检测方法技术领域，具体涉及一种定量PCR(QPCR)检测方法，尤其是涉及一种检测细胞DNA含量的QPCR法；本发明还特别涉及一种检测细胞DNA含量的方法及其试剂盒，可以在检测细胞DNA含量和大小分布中应用，尤其是涉及到MDCK细胞DNA含量和大小分布的检测。

背景技术

细胞培养来源的生物制品中残留的宿主细胞 DNA具有潜在的安全风险，故无论是产品生产和药物监管都需要确认工艺对细胞DNA的去除程度，尤其是终产品中残留细胞DNA含量检测尤其重要。2020版《中国药典》公示的三种方法：PicoGreen荧光法、DNA 探针杂交法和定量PCR法（简称QPCR法）是生物制剂开发中常用的DNA残留量的检测方法。其中，定量PCR法为2020版《中国药典》新增的方法，也是目前最适合宿主细胞核酸定量检测的方式，美国药典也将定量PCR法作为宿主细胞残留DNA 检测的唯一推荐方法。文献调研也发现，定量PCR法已经应用于疫苗中宿主细胞残留DNA的含量检测。

国际上的主要的监管机构对于疫苗等生物制品中的残留DNA的含量和残留片段的大小分布等非常关注，如中国药典2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100 pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10 ng/剂(即10ng/ml)；美国FDA发布的指导原则中指出：生物制品宿主细胞DNA残余限度为100 pg/剂，对于大剂量生物制品如单克隆抗体，根据其残留DNA来源及给药途径，DNA残留量可放宽至10 ng/剂；欧洲药典通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂；并且，WHO和美国FDA现行指导方针推荐成品中残留DNA长度不大于200 bp（相当于一个功能基因的长度）。因此疫苗生产企业质控需要检测成品中的残留DNA片段含量、大小分布情况，提高疫苗产品的安全性。

MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney cells，犬肾细胞),1958年 Madin和Darby从健康成年母犬(Cocker Spaniel，可卡犬，一种英国的小猎犬)的肾脏组织中分离培养建立，后经转化而形成传代细胞系。MDCK细胞被广泛用作远曲小管或集合管的模型、用于代谢研究和Pg级药物与药物相互作用研究，以及观察流感病毒株对细胞功能的影响，还被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。由于检测序列选择、引物探针设计和检测体系优化等方面存在难度，目前，用于定量检测MDCK细胞残留DNA检测方法和MDCK细胞残留DNA的片段大小分布情况的检测方法的检测灵敏度低，定量准确度较差等原因未能产业化，导致不能满足市场需求。随着MDCK细胞用于疫苗生产的研究越来越多，建立同时检测MDCK细胞残留DNA片段含量和大小分布的检测方法有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种新的同时检测MDCK细胞DNA片段含量和大小分布的检测方法。

为达到上述目的或目的之一，本发明提供了如下技术方案：

一种引物和探针组合物，包括3套引物和探针，分别为：根据MDCK细胞全基因组DNA设计小片段的正向引物XF1、反向引物XR1和探针XP1,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ IDNO:1-3所示；根据MDCK细胞全基因组DNA设计中片段的正向引物ZF1、反向引物ZR1和探针ZP1,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:4-6所示；根据MDCK细胞全基因组DNA设计大片段的正向引物DF1、反向引物DR1和探针DP1,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:7-9所示。