[发明专利]一种羧基化丝蛋白的方法及由其制备的羧基化丝蛋白及其应用

说明书

本发明涉及一种羧基化丝蛋白的方法及由其制备的羧基化丝蛋白及其应用。本发明提供羧基化丝蛋白的方法，包括在锂盐的存在下使丝蛋白与二羧酸酐反应的步骤。相比现有技术的丝蛋白的羧基化方法，本发明的方法具有制备条件温和，制备步骤简便的优点，同时，相对于未羧基化的丝蛋白，本发明制备得到的羧基化丝蛋白的分子量未出现下降，且表现出提高的亲水性。

本申请要求于2021年6月4日向中国专利局提交的申请号为202110625401.6的中国发明专利申请的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入本文，如同记载在本文中一样。

技术领域

本发明涉及蛋白基天然高分子材料改性技术领域，特别涉及一种羧基化丝蛋白的方法及由其制备的羧基化丝蛋白及其应用。

背景技术

蛋白基天然高分子材料，如胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白等，由于具有良好的生物相容性与生物可降解性，被广泛应用于植入介入材料、组织修复、组织工程、药物缓释等多个生物医学与生物工程领域。但是，相比于合成高分子材料，已发展的针对蛋白基天然高分子材料的化学修饰方法十分有限，并且难以制备得到具有高修饰和可控修饰度的蛋白基材料。高效化学修饰方法的匮乏极大地制约着蛋白基天然高分子材料的实际应用和未来发展。

丝蛋白，主要来源于蚕丝，是构成蚕丝的结构蛋白。由于其优异的力学性能、生物相容性和生物可降解性，近年来，受到研究者的广泛关注，特别是在生物医学领域。例如，丝蛋白薄膜可以作为制备生物传感器的基底；丝蛋白海绵可以作为组织工程支架；丝蛋白纳米小球可以作为药物传输和释放的载体；丝蛋白块材可以被加工成可植入的骨钉等。丝蛋白可以通过溶解再生的方法从天然蚕茧中提取得到，这一制备途径绿色环保，具有很好的实际应用价值。

天然家蚕丝中丝蛋白主要由重链和轻链构成，其分子量分别为390kDa和26kDa。重链和轻链间通过二硫键相连。丝蛋白中主要的氨基酸及其占比为：甘氨酸(42.9％)、丙氨酸(30％)、丝氨酸(12.2％)、酪氨酸(4.8％)、缬氨酸(2.5％)、天门冬氨酸和天门冬酰胺(2％)等。重链主要由12个结构域组成，这些结构域中包含有高度重复的氨基酸序列，形成半晶态结构。分子层面上是由β-折叠结构所形成的纳米微晶(以下简称β-折叠纳米微晶)嵌入到结晶度较小的无定形连续相中组成。天然丝蛋白经过脱胶、溶解、纯化后，会在溶液中形成高度无序的结构。通过冷冻干燥，水溶液中具有高度无序结构的丝蛋白可以被制备成具有无定形态的丝蛋白粉末。该丝蛋白粉末可以被用作一些护肤品或化妆品的添加剂。

天然丝蛋白作为一种结构蛋白，其主要特点在于力学性能优异，生物相容性好和生物可降解性好，但是其生物功能有限，特别是不具备生物相应性。所以如何构建具有特定生物功能和生物响应性的丝蛋白是目前的迫切需求，也是促进丝蛋白在更多领域，特别是生物医学领域应用的关键一环。

化学修饰丝蛋白主要是通过对丝蛋白分子链侧链官能团(如羟基、氨基等)进行化学反应，其中丝蛋白的羧基化是一个研究重点。

羧基化丝蛋白具有很好的应用前景，通过特定的化学反应将丝蛋白分子链侧链的羟基转变为羧基，进而利用点击化学方法在羧基的位点接入活性分子片段或药物，以实现丝蛋白的生物功能化。

已有研究者尝试通过氯乙酸的取代反应或次氯酸钠的氧化反应将侧链的羟基转变为羧基(Kaplan D.L.et al.Biomacromolecules 2016,17,237；Kaplan D.L.etal.Biomacromolecules 2020,21,2829；Fan Y.et al.ACS Appl.Mater.Interfaces 2016,8,14406.)，但反应条件较为苛刻，且会对丝蛋白的其他化学结构产生影响，造成丝蛋白分子量的下降。除此之外，也有研究者利用离子液体的体系对丝蛋白进行羧基化修饰(BurkeK.A.et al.Bioconjugate Chem.2020,31,1307-1312.)，但离子液体的成本较高，方法不具有经济性。因此，仍存在开发经济性，低成本的丝蛋白羧基化改性的有效方法的需求。

发明内容