[发明专利]一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法

权利要求书

1.一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于其具体步骤为：先比对鉴定荷包红鲤adh8a基因，并设计靶基因敲除靶点，然后通过体外转录的方法合成相应的sgRNA，以显微注射的方式，注射适量Cas9、sgRNA和酚红的混合体系在1细胞期荷包红鲤受精卵的动物极。

2.如权利要求1所述一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于所述鉴定荷包红鲤adh8a基因的方法为：以参考物种的ADH8a蛋白序列通过blastp比对荷包红鲤基因组蛋白序列，鉴定得到对应的核酸序列。

3.如权利要求1所述一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于所述设计靶基因敲除靶点的方法为：利用sgRNACas9软件设计靶点，CasOT软件进行靶位点唯一性的验证后得到靶点序列。

4.如权利要求1所述一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于所述合成相应的sgRNA的方法为：

利用带有靶点序列特异性F引物和具有sgRNA_scaffold序列的通用长引物R，先合成sgRNA的转录模板，然后在T7 RNA转录酶的作用下体外转录合成sgRNA，最后纯化得到用于敲除的sgRNA；

所述利用带有靶点序列特异性F引物：

5‘-GAATTAATACGACTCACTATAGGCCACATGAGTCTCTTCCATGGTTTAAGAGCTATGCTGG-3’

所述具有sgRNA_scaffold序列的通用长引物R：

5‘-AAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTCCAGCATAGCTCTTAAAC-3’。

5.如权利要求1所述一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于所述荷包红鲤受精卵的获得方法为：在水温24±0.3℃条件下，挑选性成熟的荷包红鲤，暂养于室内水泥池中，亲鱼以3～5μg/kg和1～3mg/kg的剂量注射促黄体素释放激素和地欧酮进行催产，雄鱼的注射剂量为雌鱼的一半；待亲鱼有排卵或授精行为时，用干燥洁净的毛巾擦干泄殖孔，轻轻挤压鱼体腹部得到精子和卵子；混匀适量的荷包红鲤精子与卵子，撒入水中，待卵受精沉入水底，收集粘附在培养皿的受精卵用于显微注射。

6.如权利要求1所述一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于所述Cas9、sgRNA和酚红的混合体系中，sgRNA的终浓度为1500ng/μL，Cas9蛋白终浓度为1590ng/μL。

7.如权利要求1所述一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于注射的混合体系液体体积为1～2nL。