[发明专利]一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法

说明书

一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，涉及生物技术。具体步骤：通过序列比对在荷包红鲤基因组中鉴定目的基因，设计sgRNA靶点序列及验证引物，靶点验证后通过体外转录合成靶基因sgRNA并进行纯化；将sgRNA与Cas9蛋白等体积混合后，对人工授精后的荷包红鲤胚胎进行显微注射，进行靶基因的敲除，胚胎孵化后2个月进行剪尾提取DNA，经一代测序验证得到F0代突变杂合子。为实现荷包红鲤的快速性状改良和遗传选育提供了新途径，有利于进一步开发荷包红鲤的经济价值，增加养殖收益。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体是涉及一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法。

背景技术

鲤鱼作为世界范围内广泛养殖的淡水鱼之一，不仅具有极高的食用价值，其观赏价值也得到人们的普遍认可。荷包红鲤，Cyprinus carpio var.wuyuanensis，是鲤鱼的一个变种，产于中国江西省绥源县，色泽鲜红、头小尾短、背高体宽、腹部肥大、形似荷包，肉质鲜嫩，风味极佳，具有较高的经济价值；同时荷包红鲤具有良好的杂交亲和性，能与多种鲤鲫鱼进行杂交，产生的后代具有明显的杂种优势，对我国水产养殖产业具有重要促进作用。本实验室多年来通过基因组手段展开鲤鱼发育生物学和演化机制的研究，测序、组装并注释了荷包红鲤基因组，为荷包红鲤的性状遗传解析、基因功能研究以及遗传育种的进一步开展提供了数据基础。

相对于传统的鱼类育种技术，如杂交育种，CRASPR/Cas9基因编辑技术培育新品种的目的性更强、耗时较短、成本较低，能够实现靶基因的精准编辑，较快获得目标性状的纯合突变体，这对提高鱼类育种效率，改良种质资源具有一定前景。目前CRASPR/Cas9基因编辑技术已经在尼罗罗非鱼、大西洋鲑以及各类鲤科鱼等水产经济物种中广泛应用，进行了体色形成、性别决定以及营养代谢等相关基因的功能研究，为培育和开发新品种提供了宝贵参考资料。但是在荷包红鲤中还未见有相关应用研究的报道。

荷包红鲤为异源四倍体鲤科鱼类，具有100条染色体，经历了鲤科鱼类特有的第四轮全基因组复制，基因具有多个拷贝，不同拷贝的基因序列相似性较高，并且在进化过程中，基因的不同拷贝可能发生了新功能化和亚功能化，这种复杂关系为基因编辑工作带来了极大挑战。但同时基因编辑技术也为探究多倍体物种基因不同拷贝的功能和进化命运提供了重要手段。在前人研究中adh8a基因在鲫鱼中鉴定有3个不同的拷贝(Dhillon et al,2018)，参与了乙醛清除的重要代谢过程，和鲫鱼的耐低氧性能具有密切关系，但在荷包红鲤中尚未报道该基因的拷贝数及功能研究等内容。因此在荷包红鲤中建立CRISPR/Cas9基因编辑系统，并进行该基因的鉴定和敲除，可为进一步研究开发荷包红鲤的新养殖品系，优化荷包红鲤养殖性状提供研究基础和资料。

发明内容

本发明旨在提供一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法，为其遗传育种提供新方法。采用显微注射的方法，将体外转录合成的靶基因sgRNA和Cas9蛋白与酚红溶液的混合体系注射入荷包红鲤的受精卵动物极，孵化得到靶基因突变的荷包红鲤杂合子个体。

为实现上述目的，本发明所述荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法的具体步骤为：通过序列比对鉴定荷包红鲤adh8a基因，并设计靶基因敲除靶点，然后通过体外转录的方法合成相应的sgRNA，以显微注射的方式，注射适量Cas9、sgRNA和酚红的混合体系在1细胞期荷包红鲤受精卵的动物极。

所述鉴定荷包红鲤adh8a基因的方法为：以参考物种的ADH8a蛋白序列通过blastp比对荷包红鲤基因组蛋白序列，鉴定得到对应的核酸序列。

所述设计靶基因敲除靶点的方法为：利用sgRNACas9软件设计靶点，CasOT软件进行靶位点唯一性的验证后得到靶点序列。

所述合成相应的sgRNA的方法为：