[发明专利]一种塞内卡病毒A空衣壳及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种塞内卡病毒A空衣壳及其制备方法和用途。本发明在细胞感染8h时加入10mM盐酸胍使SVA完整病毒粒子全部形成空衣壳，然后使用10％‑50％氯化铯，230000g，离心2.5h条件下分离SVA完整病毒粒子及空衣壳。为确定分离塞内卡病毒A完整病毒粒子和空衣壳的免疫效果，按2μg/鼠的剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠，之后检测特异性抗体和中和抗体变化。结果显示SVA完整病毒粒子及空衣壳免疫后诱导产生的中和抗体及特异性抗体相当。本发明的提出为塞内卡病毒A空衣壳的制备提供了新的技术手段，也为更为安全、有效的塞内卡病毒A疫苗的研究提供了技术支持，同时也为其他小RNA病毒的分离纯化奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种塞内卡病毒A空衣壳及其制备方法和用途，本发明属于生物技术领域。

背景技术

塞内卡病毒A(Seneca virusA,SVA)也称塞内卡谷病毒，是小RNA病毒科塞内卡病毒属单股正链RNA病毒。SVA引起的临床症状与口蹄疫、猪水疱病和猪水疱性口炎极其相似，难以区分，给临床诊断带来巨大挑战。自2008年SVA被证实以来，许多养猪国开始陆续报道SVA的发病情况。随着报告疫情的国家不断增多，污染面积不断扩大，中国作为全球养猪业大国，SVA迅速引起国人关注。

盐酸胍是一种典型的氢键破坏剂，可以使蛋白发生构象及聚集态结构的变化。蛋白质在高浓度盐酸胍溶液中会自发的去折叠，并且这种去折叠是可逆的，一旦回到低浓度变性剂或者无变性剂的溶液环境中，蛋白质会折叠回天然状态。盐酸胍可使酶的构象和活性中心发生改变，从而导致酶活性的变化，黄文等人在研究盐酸胍对反胶束RNaseA活性影响时发现，低浓度的盐酸胍会对RNaseA的活性产生很强的抑制作用。D Bamford和LMindich在探究破坏含脂噬菌体PRD1研究时发现，经盐酸胍处理该噬菌体释放两种蛋白P3、P5，且这两种蛋白可以形成多面体衣壳。除此之外，盐酸胍对病毒的复制增殖过程也会产生一定影响。Brown等人在口蹄疫病毒感染诱导蛋白质和RNA合成的动力学研究中发现，盐酸胍对口蹄疫病毒的复制具有抑制作用。Jacobson等人在研究脊髓灰质炎病毒的形态变化与病毒RNA、外壳蛋白之间的关联时发现，盐酸胍能够抑制新合成的RNA进入脊髓灰质炎病毒粒子内部。

在SVA分离纯化过程中，本发明人发现SVA完整病毒粒子的周边零星存在中间黑边缘白的空衣壳现象，于是本发明人就盐酸胍对SVA完整病毒粒子形成空衣壳的影响进行相关试验，并探究分离SVA完整病毒粒子及空衣壳的最佳条件以及分离后SVA完整病毒粒子及空衣壳的免疫效果，以期为小RNA病毒的分离纯化提供技术指导，同时为SVA疫苗的定量及质量控制提供数据支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种塞内卡病毒A空衣壳及其制备方法和用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种塞内卡病毒A空衣壳的制备方法，其包括以下步骤：

(1)塞内卡病毒A空衣壳的制备

1)将细胞悬液加入细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞长至80-90％时，换成2％胎牛血清培养基，按体积比1:100接入塞内卡病毒A病毒液，继续放置在培养箱中培养，在SVA感染细胞达8h时加入10mM盐酸胍，继续培养，当细胞感染达到90％时，收毒，得到含有SVA空衣壳的细胞液，-80℃冰箱待用；

2)灭活、浓缩

细胞液反复冻融三次，加入灭活剂，150rpm/min摇床摇晃28h，加入阻断剂，并检验是否灭活完全；灭活后的细胞液6000rpm/min离心30min，取上清液按照sartoriusVivaflow 200产品说明书进行浓缩，浓缩液再10000rpm/min离心30min，取上清液超速离心机40000rpm/min离心2h，沉淀用1％Trition-100PBS研磨分散，4℃过夜后，10000rpm/min离心30min，收集上清液，加入等体积的三氯乙烯去脂，8000rpm/min离心30min，收集上清液；