[发明专利]一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法。所述引物用于扩增BRAF基因目标区域，所述引物中至少有一个引物上含有可断裂位点和/或可切除序列，所述可断裂位点包括核糖核苷酸，所述可切除序列包括RNA序列和/或限制性内切酶识别序列。本发明巧妙设计用于检测BRAF基因的引物，在对BRAF基因中的目标区域进行扩增后，将可断裂位点或可切除序列带入扩增产物中，使得扩增产物在后续的切割和连接能够在同一个反应体系中进行，简化了BRAF基因突变检测的步骤，提高了检测效率。

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，涉及一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

BRAF位于染色体7q34的BRAF基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是RAF家族成员之一。BRAF蛋白与BRAF蛋白同为RAS-RAF-MEK-ERK信号通路中上游调节因子，在MAPK/ERK信号通路中起着举足轻重的作用。BRAF突变可见于多种恶性肿瘤，例如结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等。

BRAF基因突变可通过两种途径致病，一是因遗传而导致先天性缺陷的途径，二是后天获得致癌基因而导致肿瘤的途径。BRAF蛋白位于MEK/ERK途径的入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，影响细胞分化、分裂、增殖、生长。BRAF的持续激活可引起MEK/ERK信号转导紊乱，导致细胞过度增殖、恶变。

BRAF突变有40余种，90％的BRAF突变发生在编码区的1799位核苷酸T突变为A，导致其编码蛋白第600位谷氨酸被缬氨酸代替(V600E)，使得BRAF V600突变型较野生型激酶活性增强500倍，成为癌症驱动基因，具有很强的致癌作用。研究发现BRAF V600突变阳性细胞对MEK抑制剂及BRAF抑制剂非常敏感，临床试验证实BRAF V600突变阳性的非小细胞肺癌患者接受MAPK通路抑制剂维莫非尼，OS和PFS均有所延长。因此BRAF基因突变的检测对指导肿瘤患者精准用药、避免不必要的开支负担，有重大意义。

在现阶段，为了实现对BRAF基因突变的检测，可采用多种方案。其中，利用高通量测序技术实现对BRAF基因突变的检测一般包括以下步骤：(1)通过PCR扩增获得含待测定目标区域的核酸分子；(2)在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分子，获得测序文库；(3)单分子扩增所得测序文库；4)利用高通量测序技术对单分子扩增产物进行测序，得到目标区域的序列信息。

如CN114381510A公开一种用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法；包括提取cfDNA样本，基于提取的cfDNA样本，配置用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增，对扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序，采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到cfDNA样本的BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关信息。但是，为了实现这两种接头分子与含待测定目标区域的核酸分子的定向连接，需要依次进行切割、连接，或连接、切割、连接的反应，且为了保证获得文库分子的纯度，减少非目标产物(两种接头自身或相互之间连接的产物、接头连接位置错误的产物)的生成，还需要进行1至2次的分离纯化步骤，建库步骤繁杂，效率低。

综上所述，在上述方法基础上进行的BRAF基因突变检测方法步骤繁杂，检测效率低。同样，用于上述方法的BRAF基因突变检测试剂盒同样在测序过程中存在步骤繁杂，检测效率低的问题。因此，如何提供一种新的BRAF基因突变检测方法及试剂盒，简化实验步骤，提高实验效率，是BRAF基因检测领域亟需解决问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法，本发明设计检测的BRAF基因的引物，能够在同一反应体系中进行PCR扩增后的切割和连接反应，简化了建库实验步骤，提高检测效率，有效解决现有技术中步骤繁杂，检测效率低的问题，适合大范围推广应用。