[发明专利]一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法在审
申请号: | 202210636737.7 | 申请日: | 2022-06-07 |
公开(公告)号: | CN115386584A | 公开(公告)日: | 2022-11-25 |
发明(设计)人: | 林春;刘正杰;董玉梅;毛自朝;张永辉;黄玲;成钦;黎玉萍;吴贺 | 申请(专利权)人: | 云南农业大学;四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 |
主分类号: | C12N15/53 | 分类号: | C12N15/53;C12N15/54;C12N15/70 |
代理公司: | 昆明金科智诚知识产权代理事务所(普通合伙) 53216 | 代理人: | 胡亚兰 |
地址: | 650225 云*** | 国省代码: | 云南;53 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 芦笋 胆固醇 22 羟化酶 表达 载体 构建 方法 | ||
1.一种AoCYP90B27基因,其特征在于,所述AoCYP90B27基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。
2.一种应用如权利要求1所述的AoCYP90B27基因构建得到的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体。
3.一种应用如权利要求2所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法包括以下步骤:
步骤一,AoCYP90B27基因的克隆:以多年生芦笋根部组织提取总RNA,以芦笋cDNA为模板进行CDS扩增,测序,比对;
步骤二,AoCYP90B27片段克隆:以送测序的PET-AoCYP90B27T载体为模板,用引物进行片段扩增,并将扩增产物进行胶回收;
步骤三,Pcfp-AoCYP90B27表达载体构建:对扩增片段和原始载体进行线性化,室温连接;将连接产物进行转化,培养,提取表达质粒;
步骤四,Pcp-AoCYP90B27-gpdterminator载体构建:利用模板进行扩增,线性化,连接转化,培养,提取最终的表达质粒。
4.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤一中的RNA的提取包括:
以多年生芦笋根部组织根据天根RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,根据天根反转录试剂盒制备cDNA于-20℃保存备用。
5.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤一中的AoCYP90B27基因的克隆包括:
以芦笋cDNA为模板,根据AoCYP90B27 CDS设计特异性扩增引物AoCYP90B27 F和AoCYP90B27 R进行CDS扩增,扩增产物进行胶回收,并连接到T载体进行测序后,将测序结果与原序列进行核苷酸序列比对。
6.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤二中的AoCYP90B27片段克隆包括:
以送测序的PET-AoCYP90B27 T载体为模板,用引物Pcfp-AoCYP90B27 EcoRI F和Pcfp-AoCYP90B27 XmaI进行片段扩增,扩增产物进行胶回收。
7.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤三中的Pcfp-AoCYP90B27表达载体构建包括:
将步骤二扩增的基因片段和脉孢菌异源表达原始载体Pcfp myc his用EcoRI-HF和XmaI进行线性化,酶切过的载体和片段进行胶回收,回收产物凝胶电泳检测浓度,根据T4DNALigase的连接说明书加入线性化的载体和片段,室温过夜连接;将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养,挑取单克隆进行菌液PCR,阳性克隆加等体积的60%甘油,用液氮速冻保存于-80℃,并提取表达质粒Pcfp-AoCYP90B27。
8.如权利要求7所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述酶切时间为3h,所述培养条件为37℃培养16h。
9.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤四中的cp-AoCYP90B27-gpd terminator载体构建包括:
以脉孢菌87-3菌株的gDNA为模板,用引物terminator XmaI F和terminator XmaI R进行粗糙脉孢菌Ncgpd-1 terminator扩增,扩增产物进行胶回收;将表达载体Pcfp-AoCYP90B27用XmaI进行线性化,凝胶电泳检测回收产物的浓度;Ncgpd-1 terminator与线性化的表达载体根据同源重组试剂盒的说明书连接,转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α,培养,挑取单克隆进行菌液PCR,阳性克隆加等体积的60%甘油,用液氮速冻保存于-80℃,并提取最终的表达质粒。
10.如权利要求9所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述连接条件为37℃连接30min,所述培养条件为37℃培养16h。
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