[发明专利]一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法在审

专利信息
申请号: 202210636737.7 申请日: 2022-06-07
公开(公告)号: CN115386584A 公开(公告)日: 2022-11-25
发明(设计)人: 林春;刘正杰;董玉梅;毛自朝;张永辉;黄玲;成钦;黎玉萍;吴贺 申请(专利权)人: 云南农业大学;四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所
主分类号: C12N15/53 分类号: C12N15/53;C12N15/54;C12N15/70
代理公司: 昆明金科智诚知识产权代理事务所(普通合伙) 53216 代理人: 胡亚兰
地址: 650225 云*** 国省代码: 云南;53
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摘要:
搜索关键词: 一种 芦笋 胆固醇 22 羟化酶 表达 载体 构建 方法
【权利要求书】:

1.一种AoCYP90B27基因,其特征在于,所述AoCYP90B27基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。

2.一种应用如权利要求1所述的AoCYP90B27基因构建得到的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体。

3.一种应用如权利要求2所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法包括以下步骤:

步骤一,AoCYP90B27基因的克隆:以多年生芦笋根部组织提取总RNA,以芦笋cDNA为模板进行CDS扩增,测序,比对;

步骤二,AoCYP90B27片段克隆:以送测序的PET-AoCYP90B27T载体为模板,用引物进行片段扩增,并将扩增产物进行胶回收;

步骤三,Pcfp-AoCYP90B27表达载体构建:对扩增片段和原始载体进行线性化,室温连接;将连接产物进行转化,培养,提取表达质粒;

步骤四,Pcp-AoCYP90B27-gpdterminator载体构建:利用模板进行扩增,线性化,连接转化,培养,提取最终的表达质粒。

4.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤一中的RNA的提取包括:

以多年生芦笋根部组织根据天根RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,根据天根反转录试剂盒制备cDNA于-20℃保存备用。

5.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤一中的AoCYP90B27基因的克隆包括:

以芦笋cDNA为模板,根据AoCYP90B27 CDS设计特异性扩增引物AoCYP90B27 F和AoCYP90B27 R进行CDS扩增,扩增产物进行胶回收,并连接到T载体进行测序后,将测序结果与原序列进行核苷酸序列比对。

6.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤二中的AoCYP90B27片段克隆包括:

以送测序的PET-AoCYP90B27 T载体为模板,用引物Pcfp-AoCYP90B27 EcoRI F和Pcfp-AoCYP90B27 XmaI进行片段扩增,扩增产物进行胶回收。

7.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤三中的Pcfp-AoCYP90B27表达载体构建包括:

将步骤二扩增的基因片段和脉孢菌异源表达原始载体Pcfp myc his用EcoRI-HF和XmaI进行线性化,酶切过的载体和片段进行胶回收,回收产物凝胶电泳检测浓度,根据T4DNALigase的连接说明书加入线性化的载体和片段,室温过夜连接;将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养,挑取单克隆进行菌液PCR,阳性克隆加等体积的60%甘油,用液氮速冻保存于-80℃,并提取表达质粒Pcfp-AoCYP90B27。

8.如权利要求7所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述酶切时间为3h,所述培养条件为37℃培养16h。

9.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述步骤四中的cp-AoCYP90B27-gpd terminator载体构建包括:

以脉孢菌87-3菌株的gDNA为模板,用引物terminator XmaI F和terminator XmaI R进行粗糙脉孢菌Ncgpd-1 terminator扩增,扩增产物进行胶回收;将表达载体Pcfp-AoCYP90B27用XmaI进行线性化,凝胶电泳检测回收产物的浓度;Ncgpd-1 terminator与线性化的表达载体根据同源重组试剂盒的说明书连接,转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α,培养,挑取单克隆进行菌液PCR,阳性克隆加等体积的60%甘油,用液氮速冻保存于-80℃,并提取最终的表达质粒。

10.如权利要求9所述的芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法,其特征在于,所述连接条件为37℃连接30min,所述培养条件为37℃培养16h。

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