[发明专利]一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种芦笋胆固醇C‑22羟化酶异源表达载体构建方法，所述AoCYP90B27基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1；所述异源表达载体构建方法包括：以多年生芦笋根部组织提取总RNA，以芦笋cDNA为模板进行CDS扩增，测序，比对；以送测序的PET‑AoCYP90B27T载体为模板，用引物进行片段扩增，并将扩增产物进行胶回收；对扩增片段和原始载体进行线性化，室温连接；将连接产物进行转化，培养，提取表达质粒Pcfp‑AoCYP90B27；利用模板进行扩增，线性化，连接转化，培养，提取最终的表达质粒Pcp‑AoCYP90B27‑gpdterminator。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法。

背景技术

目前，基因重组表达技术在当今的生物科学研究及产业化中有着越来越广泛的应用。目前，基因重组表达的宿主生物有很多种，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和哺乳动物细胞等。很多情况下，在利用这些宿主生物表达目的基因时需要先在大肠杆菌中构建一个正确插入目的基因的环状质粒载体，将该载体提纯、线性化后再转化宿主生物，目的基因通过同源重组整合到宿主生物的基因组中，根据筛选基因可获得稳定表达的克隆子。比如常用毕式酵母(Pichia pastoris)的pPIC9K载体(Invitrogen)和中国仓鼠卵巢细胞CHO的pOptiVEC TM-TOPO载体(Invitrogen)等均属此类。

中国专利申请案(中国专利申请号02116936.5、02117763.5和02123460.4)报道了三种无需克隆的线性化载体构建方法并且注重参与连接反应的末端的产生。每个发明中分别给出一种末端产生的方法，分别是以非对称性切割的限制性内切酶酶切产生末端、DNA和RNA杂交体的RNA突出末端作为末端、切口酶及核酸外切酶作用产生末端。带有相应末端的相当于载体的片段和目的基因由T4DNA连接酶催化产生连接反应从而构建无需克隆。

但是，现有表达载体的构建方法对连接反应效率较低且极易产生错误连接，同时在实际应用中受到一定的限制，未能进一步得到推广应用。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有表达载体的构建方法对连接反应效率较低且极易产生错误连接，在实际应用中受到限制而未能推广。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法。

本发明是这样实现的，一种AoCYP90B27基因，所述AoCYP90B27基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，即LOC109833124。