[发明专利]一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法

权利要求书

1.一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括：

向收集的骨髓液中加入一定量的红细胞裂解液促使红细胞裂解，采用半换液的方法，利用BMSCs在低血清培养基中对塑料培养皿有较强的粘附性的特点，在换液的过程中逐渐除去不贴壁的杂细胞，并通过传代纯化细胞。

2.如权利要求1所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括以下步骤：

步骤一，利用PBS冲洗腿骨外部，并利用全骨髓干细胞培养液采集骨髓；

步骤二，将冲洗后的全骨髓干细胞培养液移至离心管中进行离心；

步骤三，加红细胞裂解液，吹打，静置；

步骤四，将经步骤三静置后的液体进行离心，收集细胞层；

步骤五，向细胞沉淀中加入培养液，每三天更换一半培养基；

步骤六，第9天对细胞进行传代。

3.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤一中的采集骨髓包括：

获取小猪的大腿骨，并用含3％、1％青链霉素的PBS多次冲洗腿骨外部，在无菌超净台中，用经高压灭菌后的手术刀将猪腿骨两端脆骨削开露出红色骨髓，用20mL无菌注射器头戳穿骨髓两端。

4.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤一中的采集骨髓还包括：

用10mL含1％青链霉素的PBS清洗将穿孔的猪腿骨的外部轻轻清洗干净，将穿孔的猪腿骨放于新的10cm培养皿中。

5.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤一中的采集骨髓还包括：

用1mL的一次性无菌注射器抽取5mL全骨髓干细胞培养液，从腿骨一端向另一端冲洗骨髓内部，反复冲洗骨髓3～5次。

6.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤二中的离心包括：

将冲洗后的全骨髓干细胞培养液移至15mL离心管中，1200r/min离心5min，弃上清液，得细胞沉淀。

7.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤三中的加红细胞裂解液包括：

加入步骤二所述细胞沉淀5倍体积量的红细胞裂解液，轻轻吹打细胞沉淀，静置5min。

8.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤四中的离心包括：

静置后的液体在1200r/min的转速下离心5min，弃上清，得细胞沉淀。

9.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤五中，向步骤四所述细胞沉淀中加10mL干细胞培养液，并将吹打后的细胞悬液铺于T75细胞培养瓶，每隔3d对细胞进行一次半换液。

10.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤六中，在第9天BMSCs的细胞形态明显区别于其他类型的细胞时进行传代，所述细胞传代包括：

吸出全部培养液，加入预热的PBS轻柔清洗一次，弃去PBS，加2mL胰酶消化1～3min；将培养瓶置于显微镜下观察，待细胞变圆漂浮时加入6～9mL含血清的培养基或1mL血清终止消化；用巴氏吸管吹打使细胞从培养瓶壁上脱落下来，收集液体至15mL离心管，1200r/min离心5min，弃上清；向细胞沉淀中加10mL干细胞培养液，细胞悬液铺于10cm细胞培养皿中。