[发明专利]一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，公开了一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，利用PBS冲洗腿骨外部，利用全骨髓干细胞培养液采集骨髓；将冲洗后的全骨髓干细胞培养液液移至离心管中进行离心；加红细胞裂解液，吹打，静置；将静置后的液体进行离心，收集细胞层；向细胞沉淀中加入培养液，每三天更换一半培养基，第9天对细胞进行传代。本发明采用优化操作来分离BMSCs，在骨髓液中加入红细胞裂解液，使得骨髓液中占比多的红细胞破碎裂解，提高细胞纯度；采用半换液的方法，通过少量多次的手段以保留更多的细胞。使用本发明的优化后的细胞分离培养方法，可以提高BMSCs的分离效率和纯度，避免对其活性的影响，操作简便，成本低。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法。

背景技术

目前，间充质干细胞(MSCs)可从各种组织来源分离出来，包括骨髓、脂肪、胎盘、结缔组织等，其中骨髓来源的MSCs被称为骨髓间充质干细胞(bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，BMSCs)，具有免疫调节功能和向多种细胞分化的能力，还有高增殖率的特点，具有广阔的研究和应用前景。传统的全骨髓培养法是利用BMSCs在低血清条件下具有良好的粘附能力，并在更换培养液时清除非附着的杂细胞，以实现BMSCs的分离纯化；Percoll和Ficoll浓度梯度离心法是根据BMSCs浓度与其他各组分不同从而进行分离；还有根据细胞表面标记物，采用流式细胞仪对BMSCs进行分选，流式细胞仪分选可得到高纯度的BMSCs，但对细胞的活力及分化能力影响较大，对骨髓要求量大、实验条件也较苛刻。由于BMSCs在骨髓中的含量低，细胞占比也很小，要使分离后的BMSCs有较好的活性和较高的增殖能力，采用传统的分离方法，BMSCs中通常会混杂其他细胞，导致BMSCs分离纯度不高，对其后续分化能力也有影响。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统的骨髓间充质干细胞分离方法中，BMSCs中通常会混杂其他细胞，分离效果不理想。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法。

本发明是这样实现的，一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括：

向收集的骨髓液中加入一定量的红细胞裂解液促使红细胞裂解，采用半换液的方法，利用BMSCs在低血清培养基中对塑料培养皿有较强的粘附性的特点，在换液的过程中逐渐除去不贴壁的杂细胞，并通过传代纯化细胞。

进一步，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括以下步骤：

步骤一，利用PBS冲洗腿骨外部，并利用全骨髓干细胞培养液采集骨髓；

步骤二，将冲洗后的全骨髓干细胞培养液移至离心管中进行离心；

步骤三，加红细胞裂解液，吹打，静置；

步骤四，将经步骤三静置后的液体进行离心，收集细胞层；

步骤五，向细胞沉淀中加入培养液，每三天更换一半培养基；

步骤六，第9天对细胞进行传代。

进一步，所述步骤一中的采集骨髓包括：

获取小猪的大腿骨，并用含3％、1％青链霉素的PBS多次冲洗腿骨外部，在无菌超净台中，用经高压灭菌过的手术刀将猪腿骨两端脆骨削开露出红色骨髓，用20mL无菌注射器头戳穿骨髓两端。

进一步，所述步骤一中的采集骨髓还包括：

用10mL含1％青链霉素的PBS清洗将穿孔的猪腿骨的外部轻轻清洗干净，将穿孔的猪腿骨放于新的10cm培养皿中。

进一步，所述步骤一中的采集骨髓还包括：