[发明专利]异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用

权利要求书

1.异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1，提取：将异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次8～12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1～5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品；

步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1；其中，所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为20-130g，流速为10-57mL/min；

步骤3，微孔树脂柱富集：Fr1用加入其质量5～10倍的甲醇溶解得到滤液B，滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14；之后取Fr1及Fr11-15样品适量加入甲醇配成50～100mg/mL的甲醇溶液在高效液相色谱仪上进行分析；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-150min，20-100％B，150-210min，100％B，进样量为10-55g，流速为10-57mL/min；HPLC分析条件为：ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；

步骤4，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；

步骤5，Diol二醇基柱富集：滤液C按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为280nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr142；其中，Diol二醇基柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为Diol，流动相A为正己烷，B为乙酸乙酯，色谱条件为0-90min，0-100％B，检测波长为280nm，进样量为60g，流速为57mL/min；

步骤6，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr142中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr142样品溶液，即滤液D，取1mL滤液D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；

步骤7，反相制备色谱柱制备：所述滤液D经反相制备色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1423、Fr1424和Fr1425，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr1423，含有目标化合物2和3的组分Fr1424和含有目标化合物4的组分Fr1425；其中，反相制备柱制备的工作参数为：ReproSil-Pur C18 AQ反相制备柱柱长250mm、直径20mm，固定相为5μm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B洗脱，进样体积为0.5mL，流速为19mL/min；

步骤8，Fr1423、Fr1424和Fr1425反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr1423、Fr1424和Fr1425分别用体积分数为70～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E、F和G，使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E、F和G进行分析和活性峰筛选，然后将分析条件进行线性放大，对滤液E、F和G进行反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液E、F和G制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂isodemethylfuropinarine，标记为1号；demethylfuropinarine，标记为2号；alloimperatorin，标记为3号；alloisoimperatorin，标记为4号；其中，化学结构式分别为：