[发明专利]一种制备细胞色素C的方法

说明书

本发明提供了一种制备细胞色素C的方法，属于制药领域。所述方法包括以下步骤：(1)取猪心，搅碎，提取，过滤，得到细胞色素C提取液；(2)将细胞色素C提取液经阳离子交换层析法纯化，收集洗脱液；其中，阳离子交换层析法采用的填料为SP‑琼脂糖凝胶FF树脂。利用本发明的方法制得的细胞色素C具有高纯度和高生物活性，其中的铁含量、菌内毒素含量均符合药典标准。本发明制备细胞色素C的方法工艺简单、条件温和，适合工业化应用。

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种制备细胞色素C的方法。

背景技术

细胞色素C又被称为血红素，是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间。细胞色素C广泛存在于动物的需氧组织中，集中分布于动物心肌细胞质内的线粒体膜的外表面。它在生物氧化过程中，是一个非常重要的电子传递体，可加速酶促作用的进行。细胞色素C溶液可用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。尤其在病情恶化抢救时，静脉注射细胞色素C有较好的效果。

细胞色素C易溶于水，对热、干燥、酸比较稳定，细胞色素C与线粒体内膜结合较松，较易提取。肖云(武汉职业技术学院学报，2015年，第14卷，第1期)公开了以猪心为原料提取细胞色素C的方法，该文献研究了不同的料液比、提取温度、pH、提取时间对提取效果的影响，结果表明最佳提取条件为：料液比为1:2，温度为30℃，pH为4.0条件下，提取2h，在此条件下提取率可达2.98％。但是，利用该方法所制备的细胞色素C纯度不高，达不到细胞色素C医药级的要求。

申请号为CN109694408A的中国专利申请公开了一种细胞色素C的离子交换纯化方法，包括以下工艺步骤：A、将大孔弱酸阳离子交换树脂填装于离子交换柱内，用酒精洗至流出液于水中不产生白色浑浊；用去离子水洗净层析柱中大孔弱酸阳离子交换树脂内的酒精；B、采用1N HCl 400ml、1NNaOH 400ml交替对大孔弱酸阳离子交换树脂进行转型处理；用去离子水将大孔弱酸阳离子交换树脂洗至中性，备用；C、以5-10ml/min的流速使细胞色素C提取液通过树脂交换柱；待细胞色素C提取液全部通过去离子交换柱后，用去离子水洗去层析柱内残留的细胞色素C提取液；D、用1N NaOH洗脱树脂吸附的细胞色素C；收集流出液并浓缩即得精制细胞色素C产品。但是，该方法存在以下问题：(1)细胞色素C提取液含有大量的细菌内毒素，该方法高效地去除细菌内毒素，所得细胞色素C产品中的细菌内毒素不符合药典标准(即每1mg细胞色素C中含内毒素的量应小于5.0EU)；(2)该方法所得细胞色素C产品的纯度较低，有待进一步提高。

研究出一种制备具有高纯度和低细菌内毒素含量的细胞素C成品具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备具有高纯度和低细菌内毒素含量的细胞色素C的方法。

本发明提供了一种制备细胞色素C的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取猪心，搅碎，提取，过滤，得到细胞色素C提取液；

(2)将细胞色素C提取液经阳离子交换层析法纯化，收集洗脱液；

其中，阳离子交换层析法采用的填料为SP-琼脂糖凝胶FF树脂。

进一步地，步骤(1)中，所述提取的方式为：加水，搅拌均匀，加酸调节pH至3.5-4.3，于10-20℃下提取1-3小时，调节pH至5.7-6.5。

进一步地，步骤(1)中，所述水与猪心的体积重量比为2：1ml/mg；所述加酸调节pH至3.8-4.0，所述提取的温度为15-20℃，时间为2小时；所述加碱调节pH至6.0-6.2。

进一步地，步骤(1)中，所述过滤的方式为：先用60～80目尼龙网过滤，然后将滤液经板框过滤。