[发明专利]猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途

权利要求书

1.一种猪 FAPs 细胞分离鉴定方法，其特征是：包括以下步骤：

1）猪背最长肌的分离和消化：在无菌的超净工作台中，取3～5日龄猪背最长肌，充分剪碎组织后按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶 Ⅰ ，在 37 ℃ 消化1 h，依次经70μm和40 μm的滤网过滤，离心后收集细胞；

2）猪 FAPs 细胞分选：将步骤1) 得到的细胞用PBS重悬，以细胞悬液体积：1×红细胞裂解液=1：9加入红细胞裂解液，置于4 ℃裂解5 min，随后400 g 离心5 min；再用1 mL的1×Binding buffer重悬细胞，加入100 μL 死细胞去除剂在室温孵育15 min，随后400 g 离心5 min；1×Binding buffer重悬细胞，用细胞计数器检测细胞密度，按10⁶个细胞加入2.5μg PDGFRα -Biotin抗体，于4 ℃ 孵育5 min，400 g 离心4 min；80 μL1×Binding buffer重悬细胞，加入20 μL Anti-Biotin Microbeads， 4 ℃ 孵育15 min，400 g 离心4min；用200 μL的 1×Binding buffer重悬细胞，过磁柱，停留于吸附柱上的细胞即为猪 FAPs 细胞，洗脱收集细胞；

3）猪 FAPs 细胞鉴定，得到用于免疫荧光鉴定猪FAPs细胞的特异性PDGFRα抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤3）猪 FAPs 细胞鉴定中，采用PDGFRα抗体免疫荧光鉴定且体外具有良好的增殖和成脂分化潜力，分化聚酯能力显著高的肌内脂肪前体细胞。

3. 一种根据权利要求1所述的方法得到的猪 FAPs 细胞的用途，其特征是：

1）分离得到的猪 FAPs用于研究猪肌内脂肪的形成调控及其分子机制；或者

2）用于研究猪 FAPs 细胞成脂过程中脂质代谢相关基因表达的规律以及基因功能；或者

3）用作细胞培养肉生产的种子细胞，用于细胞培养肉中肌内脂肪生产。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征是：

用带GFP荧光标签的SV40慢病毒转染猪 FAPs 细胞，转染72小时后检测GFP荧光，用于检测外源基因在调控FAPs及肌内脂肪形成中的功能及作用机制。

5. 根据权利要求3所述的用途，其特征是：将分离得到的 FAPs 接种到 12 孔细胞培养板中培养，用成脂诱导培养基 MDI medium诱导 FAPs成脂分化 4 天，然后更换分化培养基 INS medium，继续培养 2 天， 采用Bodipy 染色检测FAPs分化聚酯情况；通过实时荧光定量PCR 检测脂肪合成与代谢相关基因PPARg, Adipoq, FABP4的表达情况，用于脂质代谢基因表达检测。

6. 根据权利要求5所述的用途，其特征是：步骤4）诱导FAPs 细胞成脂分化的方法：MDImedium包含IBMX 500 μM、胰岛素10 μg/mL、罗格列酮2 μg/mL和地塞米松1 μM；INS medium包含胰岛素10 μg/mL。