[发明专利]猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途

说明书

本发明公开了猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途。方法，包括以下步骤：1）1)猪背最长肌的分离和消化；2）猪FAPs细胞分选；3）猪FAPs细胞鉴定，得到用于免疫荧光鉴定猪FAPs细胞的特异性PDGFRα抗体。得到的猪FAPs细胞的用途，1）分离得到的猪FAPs用于研究猪肌内脂肪的形成调控及其分子机制；或者2）用于研究猪FAPs细胞成脂过程中脂质代谢相关基因表达的规律以及基因功能；或者3）用作细胞培养肉生产的种子细胞，用于细胞培养肉中肌内脂肪生产。本发明对于FAPs成脂分化命运、猪肉肌内脂肪沉积调控以及细胞培养肉中肌内脂肪的培养与生产均具有重要的现实意义和应用前景。

技术领域

本发明涉及一种猪成纤维/成脂祖细胞 (fibro-adipogenic progenitors,FAPs) 分离与检测的方法及FAPs细胞的用途，属于现代农业和食品研究领域的应用技术。

背景技术

FAPs细胞是位于肌束间和肌纤维间的一类间充质细胞亚群，其典型的分子标记基因为血小板来源生长因子受体α（platelet derived growth factor receptor alpha,PDGFRα）。FAPs细胞发挥多种重要的生理功能，参与调节肌肉组织微环境、骨骼肌发育及肌肉损伤修复等。研究发现，FAPs细胞是人和小鼠肌肉再生过程中肌内脂肪细胞的主要来源，具有分化成脂肪细胞和成纤维细胞的潜能。在猪肉生产中，肌内脂肪直接影响着猪肉品质，如何调控肌内脂肪沉积对于优质猪肉生产具有重要意义。FAPs细胞的增殖、成脂分化能力及数量可能直接影响猪肉肌内脂肪的含量，但目前缺乏高效、快捷的猪FAPs细胞分离方法，关于猪FAPs细胞成脂分化命运的调控机制还未见报道。

就目前猪肌内脂肪细胞体外培养相关研究报道来看，存在一系列技术难题，比如：1）常用的差速贴壁法得到的肌内脂肪前体细胞往往包含多种类型的细胞，其成脂分化能力一般，在很大程度上制约了其在肌内脂肪形成机制和细胞培养肉等研究领域的应用； 2）由于缺乏猪肌肉中FAPs细胞的分离鉴定方法，其在体外的培养方法、有效成脂分化培养基及方法尚不得而知，其分化聚酯能力及是否可用于基因功能相关研究也需要进一步探究。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种猪 FAPs 细胞分离鉴定的方法及FAPs细胞的用途。

FAPs 细胞、分离鉴定方法及用途，包括以下步骤：

1）猪背最长肌的分离和消化：取3～5日龄仔猪，经麻醉后处死并用酒精消毒，在无菌的超净工作台中，取背最长肌，用手术剪充分剪碎组织后按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶 Ⅰ ，在 37 ℃ 消化1 h，先后经70 μm和40 μm的滤网过滤，500 g离心6min；

2）利用磁珠分选猪 FAPs 细胞：将1) 得到的细胞沉淀用洗涤液重悬，以细胞悬液体积：1×红细胞裂解液=1：9的加入红细胞裂解液，置于4 ℃裂解5 min，随后400 g 离心5min；用1 mL的1×Binding buffer重悬细胞，加入100 μL 死细胞去除剂在室温孵育15min，随后400 g 离心5 min；1×Binding buffer重悬细胞，用细胞计数器检测细胞浓度，按2.5μg / 10⁶个细胞加入CD140a-Biotin 抗体（130-101-905, Miltenyi Biotec），于4 ℃孵育5 min，400 g 离心4 min；80 μL1×Binding buffer重悬细胞，加入20 μL Anti-Biotin Microbeads（130-090-485, Miltenyi Biotec），4 ℃ 孵育15 min，400 g 离心4min；用200 μL的 1×Binding buffer重悬细胞，过磁柱，停留于吸附柱上的细胞即为猪FAPs 细胞，收集细胞；

3) 猪 FAPs 细胞的免疫荧光鉴定：将猪 FAPs 细胞接种于24孔板培养3天，3天后采用不同的PDGFRα 抗体进行免疫荧光检测，筛选得到可以用于鉴定猪FAPs细胞的特异性抗体（A2103, ABclonal Technology）；