[发明专利]一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法

说明书

本发明公开了一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β‑半乳糖苷酶的方法。属于基因工程以及微生物工程技术领域，本发明通过人工合成lacZBa基因、设计引物、PCR获得B.aryabhattai Gel‑09来源β‑半乳糖苷酶目的基因，构建重组质粒pCut‑lacZBa，并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600，得到重组枯草芽孢杆菌。以此枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产β‑半乳糖苷酶lacZBa。本发明以食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达β‑半乳糖苷酶，产酶水平高，便于分离纯化，且发酵原料来源广泛，生产成本较低。

技术领域

本发明属于酶工程和微生物工程技术领域，涉及一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，特别是涉及一种高效分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的重组枯草芽孢杆菌。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统是一种具有重要价值的原核表达系统。1958年，枯草芽孢杆菌吸收外源基因这一特性被发现，该系统逐渐被广泛研究，目前枯草芽孢杆菌表达系统已被广泛用于淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶等多种工业酶的生产中。

枯草芽孢杆菌表达系统具有众多的优点：培养条件相对简单，在成分较为普通的培养基中仍可生长到高密度；发酵工艺成熟，可以进行高密度发酵；该系统没有明显的密码子偏好且遗传性较强，噬菌体和质粒均能作为载体；另外，枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，结构简单，不含有内毒素，无致病性，也被称作食品安全菌；枯草芽孢杆菌表达系统具有强大的蛋白分泌系统，枯草芽孢杆菌中至少有4种依赖于信号肽的蛋白质分泌表达系统，具体为经典分泌途径(Sec依赖的蛋白质分泌途径)、双精氨酸分泌途径(Tat依赖的蛋白质分泌途径)、ABC分泌途径(ATP结合性盒式转运蛋白)以及假菌丝蛋白输出途径。因此，相较于大肠杆菌表达系统，外源蛋白在枯草芽孢杆菌中更易实现高效的胞外表达，除此之外，通过对枯草芽孢杆菌启动子以及表达强度的调控，更易避免包涵体的产生。

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)，全称为β-D-半乳糖苷酶，又称为乳糖酶，能够水解β-1,4-半乳糖苷键，将底物乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，有些也兼有转糖苷作用，是一种具有重要应用价值的工业酶。全世界有70％以上的成年人口存在乳糖不耐受问题，其中90％以上是东亚人。β-半乳糖苷酶能催化乳糖分子中β-1,4-糖苷键的水解，可用于无乳糖、低乳糖牛奶等乳制品的生产，具有重要应用价值。同时，乳糖的水解可以形成更多葡萄糖和半乳糖，更利于牛奶的发酵和提高酸奶中乳酸的含量。此外，乳糖水解为溶解度更高的单糖，可避免在炼乳和冰淇淋等产品中形成乳糖结晶(砂砾现象)，有利于提高产品的风味和质量。由于乳品工业对β-半乳糖苷酶的巨大需求，近年来β-半乳糖苷酶的生产受到了广泛关注。重组表达是获得高产β-半乳糖苷酶的主要方法，但表达水平却受包括目标蛋白的性质、密码子使用偏好、表达系统、发酵条件等多种因素影响。以往的研究表明，大多数细菌来源的β-半乳糖苷酶是胞内酶。胞内酶的工业化生产有许多缺点：可溶性表达较低；容易形成包涵体；下游操作过程复杂且成本高昂。因此，如何实现天然胞内β-半乳糖苷酶的胞外分泌，对β-半乳糖苷酶的高效制备具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供了一种具有高分泌能力的重组枯草芽孢杆菌，能够将天然胞内β-半乳糖苷酶高效地胞外分泌生产。

技术方案：本发明所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为宿主，以pCut为表达载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的B.aryabhattai Gel-09来源的天然胞内β-半乳糖苷酶。

进一步的，构建权利要求1所述的基因工程菌(重组枯草芽孢杆菌)的方法，将SEQID NO.2所示的编码天然胞内β-半乳糖苷酶lacZBa的基因与表达载体pCut连接，转入宿主重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600；具体的：

(1)、扩增SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶基因；