[发明专利]一种麒麟菜降血压六肽、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种麒麟菜降血压六肽，其特征在于所述降血压肽的氨基酸序列为Phe-His-Pro-Ser-Tyr-Met(FHPSYM)，ESI-MS测定分子量为766.9Da。

2.一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：以麒麟菜为原料，经超声提取粗蛋白，后经酶解、超滤、凝胶色谱纯化、RP-HPLC纯化制备得到麒麟菜降血压六肽。

3.如权利要求2所述一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)麒麟菜蛋白的制备：取麒麟菜粉末，加入磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH 7.2)，浸泡9～12h后，在频率为53kHz，功率为200W，4℃下超声45～60min，提取液纱布过滤去残渣、滤液8000r/min离心10～15min，取上清液加入硫酸铵固体使之达到100％的饱和度，沉淀45～60min，然后8000r/min离心15～20min，将沉淀加入适量蒸馏水，转移至截留分子量8～14kDa的透析袋，用蒸馏水透析除盐，透析液冻干，得麒麟菜粗蛋白；

2)麒麟菜酶解液的制备：将步骤1)中麒麟菜粗蛋白与甘氨酸-NaOH缓冲液(0.05M)混合，调节混合液pH值至9.0～10.0，调温度至40～45℃，加入碱性蛋白酶，酶解3～5h；酶解液放于沸水种5～10min后，灭酶活；溶液pH值至8.0～8.5，调温度至35～40℃，加入胰蛋白酶，酶解3～5h；酶解液放于沸水种5～10min后，灭酶活，得麒麟菜蛋白酶解液；

3)麒麟菜酶解液的超滤分级：将麒麟菜蛋白酶解液采用1kDa，3kDa和5kDa超滤膜进行超滤处理，分别收集分子量小于1kDa、1-3kDa、3-5kDa、大于5kD的组分，测定个4个超滤组分的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性，最高ACE抑制活性组分即为超滤酶解液，冻干，得超滤酶解物；

4)麒麟菜降血压肽的制备：将超滤酶解物依次经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得麒麟菜降血压肽。

4.如权利要求3所述一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于所述步骤1)中麒麟菜粉末与磷酸盐缓冲溶液的料液比为1g:10～15mL。

5.如权利要求3所述一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于所述步骤2)中麒麟菜粗蛋白与甘氨酸-NaOH缓冲液(0.05M)的重量体积比为1g：6～8mL。

6.如权利要求3所述一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于所述步骤2)中碱性蛋白酶的添加量为麒麟菜粉末质量的1.0～2.0％；所述胰蛋白酶的添加重量为麒麟菜粉末质量的1.0～1.5％。

7.如权利要求3所述一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于所述步骤4)中的羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)色谱纯化步骤为：将麒麟菜蛋白超滤酶解物配成45～55μg/mL溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析分离，用磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH 7.2)进行洗脱，根据218nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高ACE抑制活性的峰为凝胶层析酶解物，冻干。

8.如权利要求3所述一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于所述步骤4)中RP-HPLC纯化步骤为：将上述麒麟菜蛋白凝胶层析酶解物用双蒸水配成60～75μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据制备多肽的ACE抑制活性得1个高活性寡肽Phe-His-Pro-Ser-Tyr-Met(FHPSYM)，ESI-MS测定分子量为766.9Da。

9.如权利要求8所述一种麒麟菜降血压六肽的制备方法，其特征在于所述步骤4)中所述RP-HPLC条件为：进样量180～200μL；色谱柱Hypersil 300A C18(250mm×10.0mm，10μm)；流动相：40％乙腈；洗脱速度2.0～2.5mL/min；紫外检测波长218nm。

10.如权利要求1所述麒麟菜降血压六肽在制备高血压治疗药物方面的应用。