[发明专利]基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物、试剂盒及分型方法

说明书

本发明公开了基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物、试剂盒及分型方法；扩增引物包括：HLA‑A基因正向扩增引物HLA‑A_F1、HLA‑A_F2，以及HLA‑A基因反向扩增引物HLA‑A_R1、HLA‑A_R2、HLA‑A_R3；HLA‑B基因正向扩增引物HLA‑B_F1、HLA‑B_F2、HLA‑B_F3，以及HLA‑B基因反向扩增引物HLA‑B_R1、HLA‑B_R2；HLA‑C基因正向扩增引物HLA‑C_F1、HLA‑C_F2、HLA‑C_F3，以及HLA‑C基因反向扩增引物HLA‑C_R1、HLA‑C_R2；基于中国人群数据库设计，包含HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C基因的外显子及内含子，能够对中国人群I类HLA基因进行更好的扩增，通过三代测序平台进行全长测序，得到超高分辨率的基因分型。

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及基于三代测序平台的I类HLA 基因扩增引物、试剂盒及分型方法。

背景技术

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，是编码人类的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的基因。HLA 的编码基因位于人6号染色体上，包括一系列紧密连锁的基因座，由360万个碱基对组成，是目前已知的人类染色体中多态性最为丰富的区域。

编码HLA的I类基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C基因，根据国际免疫遗传项目(IMGT：International ImMunoGeneTics project)的统计结果，I类 HLA基因共包括23002个等位基因(截止2021.09，IPD-IMGT/HLA数据库3.46 版本)，其中HLA-A基因包括7114个等位基因型，B基因包括8464个等位基因型，C基因包括6855个等位基因型。I类HLA基因与临床密切相关，如在进行器官移植需要考虑供体和受体I类HLA基因的基因分型，相似程度越高，排异反应越小。

I类HLA基因与药物的毒副作用密切相关，例如，HLA-B*57:01基因型携带者在接受阿巴卡韦治疗时发生超敏反应的风险显著升高，CPIC指南不建议 HLA-B*57:01基因型携带者使用阿巴卡韦。与HLA-B*58:01基因型未携带者相比，具有一个或两个HLA-B*58:01等位基因的患者在使用别嘌呤醇治疗时，发生严重皮肤不良反应如史蒂文斯-约翰逊综合征和中毒性表皮坏死松解 (SJS/TEN)的风险显著增加。HLA-A*31:01基因型携带者在接受卡马西平治疗时发生SJS/TEN的风险增加，不建议使用卡马西平。HLA-B*15:02基因型携带者在接受卡马西平治疗时发生SJS/TEN的风险增加，不建议使用卡马西平。与HLA-C*03:02基因型未携带者相比，具有一个或两个HLA-C*03:02 等位基因的患者使用别嘌呤醇治疗时发生严重皮肤不良反应(SCAR)的风险显著升高。HLA-C*04:01基因型携带者在接受奈韦拉平治疗时发生药物不良反应(如皮肤不良反应)风险升高。

传统的I类HLA基因分型方法包括PCR-RFLP、PCR-SSO、PCR-SSP等，虽然其具有快速、成本较低等特点，但是他们都存在分辨率低，无法识别新位点，已经逐渐无法满足临床上对药物相关位点的高分辨率分型的需要； PCR-SBT分型方法虽然是目前HLA分型的金标准，但是对其结果判断要求较高，对两种alleles不易区分导致容易出现模棱两可的结果。二代测序具有通量高，测序结果准确度高等特点，在临床上有着广泛应用，但因为其短序列的特征，数据分析可能需要依赖拼接和组装，多条不同reads进行连锁分析对二代数据分型的算法也提出了更高的要求。三代测序平台目前主要包括牛津大学纳米孔测序技术平台和美国太平洋生物科学公司的PacBio测序平台，与二代测序平台相比，三代测序平台具有超长读长等特点可以将I类HLA基因进行基因组全长测序，得到两条明确的alleles，进而通过对外显子和内含子上不同SNP进行分析可以得到超高分辨率的HLA分型结果。