[发明专利]一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法

权利要求书

1.一种SARS-CoV-2类病毒颗粒的制备方法，所述方法包括将骨架质粒与膜质粒以2：1至3：1的比例转入宿主细胞中；其中，所述骨架质粒含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述膜质粒含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的方法，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：

(1)将所述的骨架质粒与膜质粒通过瞬时转染或稳定转染至宿主细胞中；

(2)所述骨架质粒是将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列插入pSG3-△env质粒所获得的；

(3)所述膜质粒是将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列插入pcDNA3.1载体，并根据宿主细胞进行密码子优化所获得的；

(4)所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；例如，293T细胞。

3.权利要求1或2所述的方法，所述方法包括：将所述骨架质粒与所述膜质粒以2：1的比例通过Lipofilter转染试剂共转染293T细胞。

4.一种SARS-CoV-2类病毒颗粒，其是通过权利要求1-3任一项所述的方法制备获得的。

5.一种筛选抗SARS-CoV-2抗体或者检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述宿主细胞与所述抗体接触；

优选地，方法包括：

步骤(i)：将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触；

步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述抗体是否是抗SARS-CoV-2的抗体；或者，在免疫斑点读板仪中对所述宿主细胞的阳性细胞数进行计数，并计算ID₅₀值，以检测抗体的中和活性。

6.一种筛选能够抑制SARS-CoV-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触；

优选地，方法包括：

步骤(i)：将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触；

步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述候选药物能否抑制SARS-CoV-2感染细胞。

7.权利要求5或6所述的方法，其中，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；

优选地，所述宿主细胞为表达ACE2的细胞，例如，293T-ACE2细胞和/或AF细胞；

优选地，所述细胞为表达ACE2和Furin的细胞，例如，AF细胞。

8.权利要求5-7任一项所述的方法，其中，在步骤(i)中，将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触36h-48h(例如，36h，38h，40h，42h，44h，46h，48h)。

9.权利要求5-7任一项所述的方法，其中，在步骤(i)中，将所述宿主细胞与所述抗体接触0.5h-1h。

10.权利要求5-9任一项所述的方法，其中，在步骤(i)中，将MOI的值为0.025的权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触。

11.权利要求5-10任一项所述的方法，其中，所述方法的步骤(i)和(ii)通过下述步骤(a)至步骤(d)进行：

步骤(a)：在96孔板中进行抗体的梯度稀释，每孔加入10ul所述抗体；

步骤(b)：每孔加入MOI＝0.025的SARS-CoV-2-Spike假病毒，孵育1h；

优选地，将所述96孔板置于37℃5％CO₂孵箱中孵育1h；

步骤(c)：每孔接种2.5x10⁴细胞/孔的表达ACE2和Furin的细胞(例如，AF细胞)，孵育36-48h；

优选地，将所述96孔板置于37℃5％CO₂孵箱中孵育36-48h；

步骤(d)：使用Biotec对AmCyan阳性的所述细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算50％中和滴度(NT50)，以评估样本的中和抗体水平；

或者，

所述方法的步骤(i)和(ii)通过下述步骤(a)至步骤(d)进行：

步骤(a)：步骤(a)：在96孔板中进行抗体的梯度稀释，稀释后将所述抗体转移至384孔板中，每孔加入10ul所述抗体；

步骤(b)：用DMEM完全培养基将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒稀释至每孔约400个GFP阳性颗粒数，每孔加10μl所述类病毒颗粒，孵育1h；

优选地，将所述384孔板置于37℃5％CO₂孵箱中孵育1h；

步骤(c)：将表达ACE2和Furin的细胞(例如，AF细胞)浓度调整为1.5x10⁵个/ml悬液，每孔加入20ul所述细胞，即每孔细胞加入量为3x10³个，孵育24h；

优选地，将所述384孔板置于37℃5％CO₂孵箱中孵育24h；

步骤(d)：在免疫斑点读板仪Biotek对AmCyan阳性的所述细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算ID₅₀值，以评估样本的中和抗体水平。