[发明专利]一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用。所述Taq DNA聚合酶突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生如下突变：E9K、L15S、D18R、H20E、H21E、K31E和R37D等。本发明通过点诱变获得Taq DNA聚合酶突变体，与野生型Taq DNA聚合酶不同，具备高效、稳定的逆转录酶活性，能够以RNA底物为高效转化cDNA，并在标准反应条件下扩增该cDNA，无需额外添加逆转录酶，能够显著提高通过实时荧光定量PCR检测目标核糖核酸(RNA)的效率。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用。

背景技术

实时RT-PCR是一种用于检测样品中RNA的方法，通过在qPCR反应中产生扩增子时检测随时间增加的荧光信号。目前，RT-PCR最广为人知的应用是在诊断实验室检测期间检测患者样本中的病毒遗传物质，例如SARS-CoV2(COVID-19)的存在。RT-PCR是用于分子生物学、医学和法医学研究的RNA靶标的检测标准。

Taq DNA聚合酶通常在分子生物学中用于在聚合酶链式反应(PCR)中扩展核酸扩增子。在PCR中，指定的DNA片段(扩增子)通过三个步骤的重复循环进行扩增：变性、退火和扩增子的延伸/扩展。使用定性实时PCR(qPCR)，通过染料或探针产生的荧光信号能够在PCR循环期间收集数据，从而可以测量和记录目标扩增。基于探针的化学方法利用荧光标记的靶标特异性探针，这些探针仅在与靶标序列结合时释放报告染料，从而可以在荧光信号强度增加时实时检测靶标扩增。

RT-PCR允许检测和扩增RNA底物。当qPCR反应中包含逆转录酶时，可以通过额外的初始循环步骤检测RNA，其中逆转录酶生成与RNA底物互补的DNA(cDNA)；然后可以通过DNA聚合酶扩增该cDNA以进行定量。当前的RT-PCR方案依赖于逆转录酶和DNA聚合酶的的组合来产生数据，在大多数情况下，Taq聚合酶仅限于对DNA底物的扩增；能够从RNA底物生成cDNA的少数实例通常依赖于非常特定的缓冲液和方案，或者依赖于732位氨基酸的天冬氨酸突变，总体而言，这些情况下的Taq活性通常不如逆转录酶强。

综上所述，如何提供一种具有高逆转录酶活性的Taq DNA聚合酶，对于RNA检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用，本发明使用定点诱变获得Taq DNA聚合酶突变体，有效提高了Taq DNA聚合酶的逆转录活性，所述Taq DNA聚合酶突变体能够高效地将RNA底物转化为DNA产物。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生如下突变：