[发明专利]一种高效获取多种生物活性功能因子的鼻黏膜外胚层间充质干细胞三维培养方法

说明书

本发明公开了一种高效获取多种生物活性功能因子的鼻黏膜外胚层间充质干细胞三维培养方法，属于干细胞及生物材料/组织工程领域。本发明提供的间充质干细胞三维悬浮培养的方法大大提高培养基内的种子细胞数量，相比二维贴壁培养增加了3‑5)，而且三维悬浮培养的细胞可长期维持干细胞特性，在体外扩增10代以上不发生明显老化和分化。进一步的，本发明在培养基内加入透明质酸，通过激活CD44受体，刺激细胞分泌各种生物活性功能因子。在培养基内加入干细胞生长因子以及抗氧化剂，以促进干细胞增殖并维持细胞的干性，以利于将细胞球打散后传代扩增。在细胞传代时收集每代细胞的条件培养基，用于获取该细胞分泌的多种生物活性功能因子。

技术领域

本发明涉及一种高效获取多种生物活性功能因子的鼻黏膜外胚层间充质干细胞三维培养方法，属于干细胞及生物材料/组织工程领域。

背景技术

干细胞/生物材料组织工程支架移植修复组织与器官损伤是一种很有临床应用前景的治疗方法。在组织与器官损伤中，大面积皮肤缺损是一种常见的严重性创伤，可以作为评估干细胞/生物材料移植修复组织与器官损伤效果的模型病例。在皮肤损伤的治疗方面，不合理的治疗方法通常会引发细菌感染、组织脱水以及严重的二次创伤，严重危害人体健康。皮肤损伤的传统治疗方法包括自体皮移植、同种异体去细胞皮移植、异种去细胞皮移植以及干细胞/人造皮肤(贴膜)移植等。在上述治疗方法中，自体皮移植疗效肯定，没有排斥反应，是治疗皮肤缺损的首选方法，但是自体皮移植存在自体皮来源不足、供皮区创面形成疤痕和色素沉着等问题；异体皮移植因为会发生严重的排斥反应现，现已很少应用。在干细胞移植治疗皮肤或其它组织损伤方面，虽然已经取得了一些进展，但是自体干细胞的来源有限，而且细胞培养扩增周期较长，往往会错过最佳治疗窗口期；而异体干细胞移植同样会有具有排斥反应。因此，利用不含活细胞的干细胞分泌的生物活性功能因子联合生物材料制作具有促进组织再生的复合生物材料支架(贴膜)用于修复组织损伤，将可弥补上述组织/干细胞移植存在的不足。

基于干细胞条件培养基内含有种子细胞分泌的多种生物活性功能因子，如何高效获取这些功能因子，用于修复组织和器官损伤，很有实际研究价值。目前，用于修复组织损伤的各种生物活性功能因子主要包括生长因子(如EGF，bFGF，KGF，VEGF等)和细胞外基质蛋白(如Laminin，Fibronectin等)两大类，这些生物活性功能因子主要是转基因生物工程产品，生产过程复杂，生产成本很高，价格昂贵。这些因素限制了上述功能因子的推广应用。因此，从干细胞培养基内高效提取上述功能因子是一种很有应用前景的因子生产方法。但是，用常规方法进行干细胞培养时，细胞呈单层生长，单位体积培养基内的细胞密度较低，细胞外基质与细胞因子含量较少。同时，在单层贴壁生长过程中种子细胞很容易自发分化，分泌能力很快下降，从其条件培养中获取足量的功能因子比较困难。如果用悬浮细胞三维培养方法培养种子细胞，普通类型的细胞会因为脱离与细胞外基质的接触而发生失巢凋亡(Anoikis)，大部分类型的干细胞在悬浮状态下也会通过激发自噬而进入休眠状态，使其不适合用于悬浮三维培养。因此，选择一种在体外培养过程长中不容易老化并且具有抗失巢凋亡的干细胞，进行悬浮成球三维培养可以很大程度提高单位体积培养基内的细胞密度，提高生物活性功能因子的产量。

发明内容

本发明的预实验结果表明，人和大鼠的鼻粘膜EMSC具有抗失巢凋亡的能力，在抗贴壁悬浮培养的情况下，细胞可聚集成多细胞球。据此，本发明选择该细胞作为三维悬浮培养的种子细胞，将鼻粘膜组织接种到底面铺有琼脂糖的培养瓶内，置水平摇床上慢速摇动悬浮培养。

本发明的第一个目的是提供一种鼻黏膜外胚层间充质干细胞培养基，所述培养基的组成为基础培养基、抗生素、缓冲剂和添加剂。

在一种实施方式中，所述基础培养基为高糖DMEM和F12按1:1配制。

在一种实施方式中，所述抗生素为青霉素和链霉素。

在一种实施方式中，所述缓冲剂为HEPES。

在一种实施方式中，所述添加剂为透明质酸、干细胞生长因子、抗氧化剂和/或细胞代谢营养物质。