[发明专利]一种诱导成纤维细胞转分化为肾脏上皮细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导成纤维细胞转分化为肾脏上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建逆转录包装质粒；

所述的逆转录包装质粒中携带有四种重编程因子，四种重编程因子的组合方式选自以下任一：

Hnf1β-P2A-Emx2-Puromycin+Hnf4α-P2A-Pax8-Blasticin，

Hnf1β-P2A-Hnf4α-Puromycin+Emx2-P2A-Pax8-Blasticin，

Hnf1β-P2A-Pax8-Puromycin+Hnf4α-P2A-Emx2-Blasticin；

或，所述的逆转录包装质粒中携带有三种重编程因子，三种重编程因子的组合方式选自以下任一：

Hnf1β-Puromycin+Emx2-P2A-Pax8-Blasticin，

Hnf1β-Puromycin+Hnf4α-P2A-Pax8-Blasticin，

Hnf4α-Puromycin+Emx2-P2A-Pax8-Blasticin，

Hnf1β-Puromycin+Hnf4α-P2A-Emx2-Blasticin；

S2、逆转录病毒包装；

S3、逆转录病毒包装后感染成纤维细胞，诱导成纤维细胞转分化为肾脏上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的诱导成纤维细胞转分化为肾脏上皮细胞的方法，其特征在于，所述的成纤维细胞是用孕12.5至14天的孕鼠，其胚胎用于提取小鼠胚胎成纤维细胞。

3.根据权利要求2所述的诱导成纤维细胞转分化为肾脏上皮细胞的方法，其特征在于，所述的小鼠胚胎成纤维细胞的制备方法为：将胚胎外的胞膜小心去除，去除头部和内脏，剪刀将组织剪碎，加入1mL 0.05％胰酶，将组织转移至15mL离心管中，37℃水浴锅消化，每隔5min混匀一次，消化约15min后加入含10％FBSDMEM培养基中终止消化；将消化完全的原代胚胎成纤维细胞铺入培养瓶中培养。

4.根据权利要求1所述的诱导成纤维细胞转分化为肾脏上皮细胞的方法，其特征在于，步骤S1中逆转录包装质粒构建的方法包括以下步骤：

在逆转录病毒骨架质粒pMXs中构建3种由2A多肽剪切位点P2A分离的双顺反子逆转录病毒载体原件，并在原件中添加Puromycin和Blasticin双抗生素筛选策略，4种转录因子的cDNA片段通过PCR的方法获得后，通过同源重组的方法连接到双顺反子的载体原件中，获得Emx2-P2A-Pax8-Blasticin，Hnf4α-P2A-Pax8-Blasticin和Hnf4α-P2A-Emx2-Blasticin 3种类型的Blasticin(BSD)双顺反子载体原件，以及Hnf1β-P2A-Emx2-Puromycin，Hnf1β-P2A-Hnf4α-Puromycin和Hnf1β-P2A-Pax8-Puromycin 3种类型的Puromycin(Puro)双顺反子载体原件，选取之前构建成功的3种类型的双顺反子原件，组合建立三种四因子重编程组合，即H1E-Puro+H4P-BSD，H1H4-Puro+EP-BSD，H1E-Puro+H4E-BSD；

在逆转录病毒骨架质粒pMXs中构建3种由2A多肽剪切位点P2A分离的双顺反子逆转录病毒载体原件，并在原件中添加Puromycin和Blasticin双抗生素筛选策略，4种转录因子的cDNA片段通过PCR的方法获得后，用同源重组的方法连接到双顺反子的载体原件中，获得Emx2-P2A-Pax8-Blasticin，Hnf4α-P2A-Pax8-Blasticin和Hnf4α-P2A-Emx2-Blasticin 3种类型的双顺反子载体原件；选取这3种类型的双顺反子原件，同时构建2种单因子的质粒，包括Hnf1β-Puromycin和Hnf4α-Puromycin，组合建立四种三因子重编程组合，即H1β-Puro+EP-BSD，H1β-Puro+H4P-BSD，H4α-Puro+EP-BSD和H1β-Puro+H4E-BSD。