[发明专利]一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD及其作为疫苗抗原的应用

说明书

本发明提供了一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示，本发明还提供了上所述抗原蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开该重组蛋白MrkD在制备用于诊断或防治肺炎克雷伯菌感染的药物中的应用。采用本发明提供的重组蛋白可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD及其作为疫苗抗原的应用。

背景技术

肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，KP)常定植于人体肠道和呼吸道，是临床上常见的条件致病菌之一(Martin RM,Bachman MA.Front Cell Infect Microbiol,2018)，其可在全身各部位导致感染发生，常见于老年患者、营养不良、慢性酒精中毒、慢性疾病和全身衰竭的患者，可引起肺炎、尿路感染、脑膜炎、全身败血症等全身或局部感染，严重时危及患者生命安全(Akova M,Daikos GL，Tzouvelekis L，et al.Clin MicrobiolInfect,2012)。近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)在临床上检出率逐年增加，因其超强的耐药性和致病性被称为“超级细菌之王”，给临床治疗制造巨大的阻碍，因此也成为目前研究关注的热点(Munoz-Price LS,Poirel L,Bonomo RA，et al.Lancet Infect Dis,2013)(Hu F，Zhu D,Wang F.et al.Clin Infect Dis，2018)。有研究表明，对碳青霉烯类抗菌药物敏感的KP感染致死率为20％～30％，而CRKP感染致死率可达40％～70％(IredellJ，Brown J，Tagg K.mechanisms and clinical implications.BMJ.2016)(Nordmann P，Cuzon G，Naas T.Lancet Infect Dis.2009)，严重威胁人类健康，考虑到其日益严峻的耐药形势，研发新的防治手段迫在眉睫。疫苗接种能有效保护机体免受细菌侵害，并且不受抗生素耐药机制的影响，是一种非常有潜力的防治手段。

肺炎克雷伯菌的灭活疫苗由于安全性有限，当前没有获批上市的相关药物产品。随着免疫学、分子生物学、纳米科学等学科的不断发展，细菌疫苗的类型、组成都发生了很大变化，出现了多糖疫苗、多糖结合疫苗、蛋白疫苗、纳米疫苗等新型疫苗(Hackett RJ,Marcus S.Infect Immun,1970)。全菌及灭活疫苗发挥作用的组分较为复杂且安全性较低，单纯的多糖组分免疫原性较差，可通过与其他组分如载体蛋白结合来提高免疫效果。重组亚单位疫苗是很有前景的疫苗类型。

发明内容

本发明通过反向疫苗学的方法，对肺炎克雷伯菌全基因组进行分析，筛选出潜在的抗原决定簇，对其进行高通量的克隆、表达、纯化，并在动物体内进行保护性评价，从而筛选出了150多种具有保护性的候选抗原，并对其中42种候选抗原进行动物体内保护性评价，从而筛选出了一系列具有保护性的候选抗原。其中，筛选出MrkD蛋白为菌毛粘附蛋白，与细菌毒力相关，研究结果表明：mrkD基因阳性率为94％，与其他测试基因rmpA、Irp-1和magA基因相比更丰富(Ahmadi M et al.,Expert Rev Anti Infect Ther.2022)。将上述MrkD抗原蛋白表达纯化后与氢氧化铝作为佐剂制备疫苗，免疫BALB/C小鼠，在多次动物攻毒保护实验中疫苗保护率在50％左右，体现出较好的保护效果，同时，能够诱导高效的体液免疫应答，可作为有效的疫苗候选抗原组分。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用作肺炎克雷伯菌抗原的重组蛋白MrkD，其氨基酸酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明还提供了上述的重组蛋白MrkD的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明进一步提供了一种表达载体，其包含骨架质粒和上述的编码基因。