[发明专利]曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用

权利要求书

1.一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物MA-Pf和下游引物MA-Pr，所述上游引物MA-Pf的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物MA-Pr的序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针为MA-Probe，该探针MA-Probe的序列如SEQ ID NO.3所示；所述探针MA-Probe的5'端标记有荧光报告基团FAM，其3'端标记有淬灭基团BHQ1。

2.如权利要求1所述的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于，所述曼氏杆菌属细菌包括溶血性曼氏杆菌、反刍动物曼氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌、葡萄糖苷曼氏杆菌、豚鼠曼氏杆菌、异源曼氏杆菌、布莱克尔曼氏杆菌、牛曼氏杆菌和绵羊曼氏杆菌共9个种细菌。

3.一种非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述TaqMan实时荧光定量PCR检测所用的引物和探针为如权利要求1所述的引物和探针；该检测方法包括以下步骤：

(1)提取检测样品的细菌基因组DNA作为模板；

(2)使用所述引物和探针进行实时荧光定量PCR反应；

(3)反应结束后，根据检测样品的扩增曲线直接判定检测样品中是否存在曼氏杆菌属细菌。

4.如权利要求3所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应包括：

PCR反应体系为：ddH₂O 8.0μL，荧光定量预混试剂2×SuperReal PreMix 10μL，50×ROXPreference Dye 0.3μL，浓度为10μmol/L的上游引物MA-Pf 0.3μL，浓度为10μmol/L的下游引物MA-Pr 0.2μL，浓度为10μmol/L的探针MA-Probe 0.2μL，模板1μL；

PCR反应条件为：(1)95℃15min；(2)95℃3s、64℃30s并收集荧光信号，40个循环；

标准曲线方程为：

Y＝43.132-4.046×logX    (1)

公式(1)中：Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数。

5.如权利要求4所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：

将检测样品的C_t值代入方程(1)中即可以计算出检测样品中曼氏杆菌属细菌DNA的起始拷贝数，再根据提取DNA所用的检测样品的质量，推算出检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对含量，从而实现对检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测。

6.如权利要求3所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：

所述判定检测样品中是否存在曼氏杆菌属细菌属于定性检测，所述定性检测结果判定标准为：检测样品的荧光定量PCR反应出现扩增曲线为阳性，表示检测样品中存在曼氏杆菌属细菌DNA；检测样品的荧光定量PCR不出现扩增曲线为阴性，表示检测样品中不存在曼氏杆菌属细菌DNA。

7.如权利要求3-6任一项所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：

所述曼氏杆菌属细菌包括溶血性曼氏杆菌、反刍动物曼氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌、葡萄糖苷曼氏杆菌、豚鼠曼氏杆菌、异源曼氏杆菌、布莱克尔曼氏杆菌、牛曼氏杆菌和绵羊曼氏杆菌共9个种细菌。

8.如权利要求7所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：能够在1个反应管里同时检测所述9个种细菌。

9.一种如权利要求3-8任一项所述的一种非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法在实现对曼氏杆菌属细菌的非疾病诊断目的的快速鉴定中的应用。