[发明专利]曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用，引物包括上游引物MA‑Pf和下游引物MA‑P，探针为MA‑Probe，序列分别如SEQ ID NO.1、NO.2和SEQ ID NO.3所示，探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，探针的3'端标记有淬灭基团BHQ1。利用引物和探针建立的TaqMan实时荧光定量PCR能在1个反应管里同时检测曼氏杆菌属全部9个种细菌，且不与牛羊常见的细菌发生交叉反应。该方法具有特异性强、灵敏性高、重复性好、检测快速、操作简便、成本低廉等优点，可用于曼氏杆菌属细菌的快速鉴定和牛羊组织样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测，为牛羊曼氏杆菌属细菌感染的高通量快速检测提供了可靠方法。

技术领域

本发明属兽医微生物检测技术领域，具体涉及一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用。

背景技术

曼氏杆菌属(Mannheimia)细菌包括溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)、反刍动物曼氏杆菌(M.ruminalis)、肉芽肿曼氏杆菌(M.granulomatis)、葡萄糖苷曼氏杆菌(M.glucosida)、豚鼠曼氏杆菌(M.caviae)、异源曼氏杆菌(M.varigena)、布莱克尔曼氏杆菌(M.pernigra)、牛曼氏杆菌(M.bovis)和绵羊曼氏杆菌(M.ovis)共9个种。曼氏杆菌属细菌是牛羊等反刍动物的重要条件致病菌，其中，溶血性曼氏杆菌感染最为常见，能引起牛羊肺炎、乳房炎^[1,2]；葡萄糖苷曼氏杆菌能引起山羊乳房炎和羚羊肺炎^[3,4]；肉芽肿曼氏杆菌能引起牛的肺炎、乳房炎和下颚肉芽肿^[5-7]；异源曼氏杆菌能引起牛的肾盂肾炎和脑膜炎^[8,9]；反刍动物曼氏杆菌能引起绵羊乳房炎^[10]；豚鼠曼氏杆菌是豚鼠结膜炎和中耳炎的相关病原体^[11]；牛曼氏杆菌是牛肺炎的相关病原体^[12]；绵羊曼氏杆菌是绵羊肺炎的相关病原体^[13]；曼氏杆菌感染严重危害牛羊等反刍的健康，给牛羊等反刍动物的养殖造成严重的经济损失^[14]，因此，建立曼氏杆菌属细菌病原快速检测方法对牛羊等反刍动物曼氏杆菌感染的预防和控制具有重要意义。

实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)方法具有敏感性高、特异性强、反应快速和适用于高通量检测等诸多优点，广泛应用于多种动物疫病快速检测。实时荧光定量PCR检测方法分为两种，一种是染料法实时荧光定量PCR方法，另一种是探针法实时荧光定量PCR方法。染料法实时荧光定量PCR方法具有操作简便，成本也相对较低的优点，但由于染料法实时荧光定量PCR方法检测的是反应体系中所有双链DNA，一些非特异扩增或引物二聚体的出现都将严重影响检测结果的准确性，导致染料法实时荧光定量PCR方法的特异性不如探针法实时荧光定量PCR方法。

探针法实时荧光定量PCR检测的是反应体系中的目标序列，不受非特异性扩增和引物二聚体的影响，使得探针法实时荧光定量PCR方法的特异性优于染料法实时荧光定量PCR方法。目前，曼氏杆菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法相关报道少见，仅见溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR检测方法的研究报道^[15,16]和Guenther等^[17]报道的检测曼氏杆菌属5个种细菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，缺乏一种能在同一个反应管内同时检测曼氏杆菌属全部9个种细菌的实时荧光定量PCR检测方法。

参考文献

[1]Amat S,Timsit E,Baines D,et al.Development of BacterialTherapeutics against the Bovine Respiratory Pathogen Mannheimia haemolytica[J].Appl Environ Microbiol,2019,85(21):e01359–19.