[发明专利]一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种生产D‑柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法，本发明在前期构建的菌株MKL8的基础上继续优化前体乙酰辅酶A和NADPH辅因子水平，为胞内柠檬烯合成创造了较优条件，并增加胞内柠檬烯合酶拷贝数由2个至8个，摇瓶发酵实现产量由原来的657mg/L，提升至1248mg/L，比原产量提高1.90倍。再运用区室化工程将柠檬烯合成全途径酶定位至线粒体，实现重组酿酒酵母菌株柠檬烯在线粒体内的同步高效合成。综合运用细胞质与线粒体双重调控使柠檬烯的产量得到进一步的提升至1392mg/L，最终实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，重组酵母菌株相对于原菌株具有较好的生长速率，具有较大的应用推广价值。

技术领域

本发明涉及一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

萜类化合物，又称类异戊二烯，由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物构成，是植物的次生代谢产物。柠檬烯属于单环单萜类化合物，是一种来源于植物的天然活性化合物，化学式为C₁₀H₁₆，易挥发，性质较稳定，柠檬烯分子内只含有一个手性碳原子，因此柠檬烯有D-柠檬烯和L-柠檬烯两种光学异构体，以及一种外消旋体D/L-柠檬烯，目前D-柠檬烯在自然界存在更广泛，应用也最多。在食品工业中，D-柠檬烯具有防腐保鲜、抑菌、抗氧化等功能；在医药行业中，D-柠檬烯可以用于制备具有抗肿瘤、祛痰平喘、利胆溶石功能的药物；在香料、洗护行业，D-柠檬烯可用作做精油、温和洗涤剂等；在农业方面，D-柠檬烯可用于制备天然源农药，具有环境易降解的优点。

目前D-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的，但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点，大量提取D-柠檬烯受原料与工艺的限制。利用化学方法也能够合成柠檬烯，但化学合成法需要采用高温、高压和昂贵的催化剂，而且生产设备复杂、原料利用率低、环境污染严重。本世纪初合成生物学技术的兴起，为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具，打破了物种间的界限，使微生物异源合成D-柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成D-柠檬烯的微生物细胞工厂，实现微生物发酵法替换传统的植物提取法和化学合成法，具有重要的经济与社会效益。目前代谢工程应用于柠檬烯的生产主要以酿酒酵母与大肠杆菌为底盘细胞，酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂，被广泛的应用于各种生物燃料、化工产品、医药保健品等的合成，酿酒酵母在萜类化合物的生产中应用较广泛。

Si Cheng等人通过工程改造竞争性基因ERG20的葡萄糖感应启动子HXT1以及引入由植物NPPS和植物LS利用底物NPP组成的OLB途径等策略，补料分批发酵实现柠檬烯产量917.7mg/L。胡智慧等人采用过表达或共过表达MVA关键基因、关键酶启动子优化，关键酶点突变随机突变相结、表达相关转运蛋白以增加耐受性等策略，连续发酵实现柠檬烯产量62.31mg/L。Xue Zhang等人通过设计PDH旁路简化MVA途径、弱化竞争旁路，增加胞质乙酰辅酶A含量，摇瓶补料发酵120h柠檬烯产量达到1446.56mg/L，罐上分批补料发酵实现柠檬烯产量2230mg/L，是目前国内外报道的产量最高水平。关于合成生物学的技术和方法，目前国内外现有技术柠檬烯产量无法满足工业化应用的要求。申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌MKL8，已实现D-柠檬烯摇瓶发酵657mg/L，该菌株生产D-柠檬烯的能力仍有较大的提升空间。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株，综合运用细胞质与线粒体双重调控使柠檬烯的产量得到进一步的提升。

本发明的第一个目的是提供一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株，所述的菌株以酿酒酵母MKL8为宿主，敲除了柠檬酸合酶基因CIT2和谷氨酸脱氢酶(NADP(+))基因GDH1，并增加了柠檬烯合酶tLimS拷贝数。

进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1所示的序列：