[发明专利]腺相关病毒突变体及其应用

权利要求书

1.一种腺相关病毒突变体，其特征在于，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的腺相关病毒突变体；

优选地，所述核酸分子的核酸序列包括SEQ ID NO:7所示的序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括插入有权利要求2所述的核酸分子的野生型腺相关病毒载体；

优选地，所述野生型腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2。

4.一种腺相关病毒库，其特征在于，所述腺相关病毒库包括权利要求1所述的腺相关病毒突变体。

5.一种权利要求4所述的腺相关病毒库的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)PCR扩增野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因；

(2)将扩增产物采用DNA酶消化后，选取长度为100～300bp的DNA片段进行重新拼接；

(3)将拼接产物插入野生型腺相关病毒载体中，得到腺相关病毒载体库；

(4)将所述腺相关病毒载体库与辅助质粒共转染哺乳细胞后，制备得到所述腺相关病毒库。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的PCR引物包括SEQ ID NO:11～12所示的核酸序列；

优选地，步骤(2)所述拼接方法为将长度为100～300bp的DNA片段与DNA聚合酶混合，在96～41℃范围内进行梯度降温，通过ShufflingPCR得到拼接产物；

优选地，步骤(3)所述野生型腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2。

7.一种权利要求1所述的腺相关病毒突变体的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求4所述的腺相关病毒库与人静脉注射用人免疫球蛋白混合孵育，随后导入肝脏细胞人源化小鼠中；

导入腺病毒，饲养一段时间后，分离小鼠肝脏中的人源细胞，提取DNA；

采用SEQ ID NO:13～14所示的引物对进行PCR扩增，将扩增产物插入野生型腺相关病毒载体，与辅助质粒共转染哺乳细胞；培养后裂解哺乳细胞，得到所述腺相关病毒突变体。

8.一种腺相关病毒突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求3所述的表达载体与辅助质粒共转染哺乳细胞；培养后裂解哺乳细胞，得到所述腺相关病毒突变体。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的腺相关病毒突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的腺相关病毒库中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

10.一种权利要求1所述的腺相关病毒突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体、权利要求4所述的腺相关病毒库或权利要求9所述的药物组合物在制备基因缺陷病治疗药物中的应用；

优选地，所述基因缺陷病包括血友病、先天性黑曚、杜氏肌营养不良症或脊髓性肌萎缩症中的任意一种或至少两种的组合。