[发明专利]腺相关病毒突变体及其应用

说明书

本发明提供了腺相关病毒突变体及其应用，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白包括SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1～5具有98％以上同一性、且具有相同或相似生物学功能的氨基酸序列。本发明通过对野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因进行拼接重组，构建腺相关病毒库，采用抗AAV外壳蛋白的中和抗体筛选得到腺相关病毒突变体，对人源肝脏细胞的感染能力强，并能够躲避中和抗体的中和作用，有针对性地解决了血友病治疗领域存在的技术障碍。

本申请是申请号为202010442092.4专利申请的分案申请(原申请的申请日为2020年5月22日，发明名称为腺相关病毒突变体及其应用)。

技术领域

本发明属于基因工程和生物工程技术领域，涉及腺相关病毒突变体及其应用。

背景技术

最近几年，腺相关病毒(AAV)作为基因治疗的载体应用于临床治疗多种基因缺陷病，如B型血友病、DMD进行性肌萎缩、SMA运动障碍等，取得了令人振奋的结果。尤其是AAV在血友病治疗中的成功应用，有望挽救成千上万个对常规治疗手段无效的病人。有文献报道，注射承载九因子基因的AAV后，血友病病人未出现严重的免疫反应，AAV对肝脏的损伤也是一过性的；注射AAV后，病人外周血中九因子的水平恢复至正常水平的10％左右，并且长期稳定表达，基本脱离了对九因子重组蛋白的依赖性。针对八因子缺失导致的A型血友病，初步的临床实验正在进行中。但是，编码凝血八因子的基因较长，约4.5kbp，加上启动子和终止序列，全序列的基因长度已经超过了AAV的包装范围，这是AAV基因治疗方法在治疗A型血友病中遇到的主要障碍，也是目前的研究热点。

然而，AAV基因治疗方法在治疗血友病方面也存在一些局限性。其中之一在于正常人和血友病病人的外周血中存在一定比例的抗AAV外壳蛋白中和抗体，因此，在评估病人能否进行AAV基因治疗前，需要首先检测外周血中是否存在中和抗体，如果病人体内存在抗AAV的中和抗体，便不适合进行AAV基因治疗。考虑到AAV基因治疗方法是具有广泛前景的血友病治疗方法，帮助AAV躲过体内中和抗体的清除作用就显得特别重要。

针对这一问题，研究人员提出了多种方法，包括空壳蛋白中和法、免疫抑制剂预处理法、小片段DNA中和法、AAV外壳蛋白突变法等。空壳蛋白中和法是指在注射AAV时，混入大量的AAV空壳蛋白，用以抵消AAV被体内中和抗体清除的压力，从而增加感染效率。但是研究发现，AAV空壳蛋白更容易被抗原提呈细胞提呈，激发强烈的T细胞免疫反应，增强了T细胞对AAV的清除效果，最终导致AAV的转导效率变低。免疫抑制剂预处理法是指在注射AAV前，给病人注射适量的免疫抑制剂，如地塞米松，这种方法虽然可以在一定程度上提高AAV的转导效率，但是提高程度有限，因为地塞米松对免疫的抑制是广泛的，不能特异性清除针对AAV的中和抗体以及识别AAV的T/B细胞。小片段DNA中和法是指使用能够特异性封闭AAV中和抗体的小片段DNA，应用前景较好，但是尚未出现相关临床应用报道。AAV外壳蛋白突变法是指将中和抗体识别的AAV外壳蛋白氨基酸序列中的某些位点进行突变，降低中和抗体对AAV的识别能力，从而躲避中和抗体的清除作用，目前有大量的研究报道，但是躲避中和抗体的原因和方式尚无法阐明。

因此，对AAV进行改造从而躲过体内中和抗体的清除作用，提高AAV的适用范围，在基因缺陷病治疗领域具有重要意义和广泛的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了腺相关病毒突变体及其应用，所述腺相关病毒突变体对人源肝脏细胞的感染能力强，并能够躲避中和抗体的中和作用，有针对性地解决了存在抗AAV中和抗体的血友病患者在接受基因治疗时遇到的障碍。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种腺相关病毒突变体，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白包括SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：