[发明专利]基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法

权利要求书

1.基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)针对特异致病基因保守序列设计sgRNA，包含sgRNA的PCR引物，采用PCR结合LbCpfl酶切方法筛选得到目标sgRNA；

(3)设计LAMP引物，以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，进行LAMP扩增；

(4)以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，步骤(2)设计的PCR引物，扩增特异致病基因IpaH，构建至pMD-19T克隆载体，构建pMD19T-IpaH质粒；以十倍比例倍比稀释质粒作为LAMP扩增的模板；

(5)荧光可视检测，将LAMP扩增产物、LbCpf1、荧光探针、目标sgRNA、NEB Buffer2.1混匀，孵育10～30min，在蓝光或紫外光下裸眼可视对样品中宋内氏志贺氏菌的定性检测。

2.根据权利要求1所述的基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中设计的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；包含sgRNA序列的宋内氏志贺氏菌特异致病基因IpaH基因前向和后向引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：8、9所示，用于普通PCR，结合LbCpf1酶切筛选得到目标sgRNA。

3.根据权利要求1所述的基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中设计的LAMP引物，包含针对目标sgRNA序列的宋内氏志贺氏菌特异致病基因IpaH靶标序列的引物组，其中包括外引物F3，F3的核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示；外引物B3，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；内引物FIP，FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；内引物BIP，BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；环引物LF，LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；环引物LB，LB的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。

4.根据权利要求1所述的基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中设计的LAMP的扩增体系为25μL体系，1.6μM内引物1和内引物2，0.2μM外引物1和外引物2，0.4μM环引物1和环引物2，8U的Bst3.0酶，1.4mM的dNTPs，8mM的MgSO4，6.7×10^-14～6.7ng模板DNA和1×Bst buffer；扩增条件为65℃孵育15～50min。

5.根据权利要求1所述的基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中构建pMD19T-IpaH载体的方法为：以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，步骤(2)设计的PCR引物进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，连接pMD-19T克隆载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌送测序，序列比对完全正确的单克隆菌扩大培养，提取质粒，即获得pMD19T-IpaH载体。

6.根据权利要求1所述的基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中所用的荧光探针序列为随机的12碱基，该探针的5’端用JOE修饰，3’端用BHQ1修饰。

7.根据权利要求1所述的基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中荧光可视检测体系为20μL体系，包括LAMP扩增产物2μL，LbCpf1的浓度为10nM，132ng目标sgRNA，0.7μM JOE探针，1×NEB 2.1 buffer和DEPC水；反应条件为37℃孵育10～30min。