[发明专利]基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法

说明书

本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a系统结合环介导等温扩增(LAMP)快速检测宋内氏志贺氏菌的方法，属于微生物检测领域。本发明利用CRISPR系统Ⅱ类Ⅴ型的Cas12a蛋白对特定核酸DNA切割产生的“附属切割”活性，设计荧光报告探针，实现对宋内氏志贺菌特异致病基因的LAMP扩增产物的快速检测。本发明所述方法仅需要恒温装置和简易的荧光检测装置，即可实现1小时内完成检测，检测结果可通过裸眼判定，简便、灵敏、高效地实现现场检测，所述方法在食品安全、生物检测以及市场监管等领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术领域，具体涉及基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法。

背景技术

志贺氏菌属是一类目前最常见的导致细菌性痢疾的食源性病原菌。宋内氏志贺菌是痢疾流行的主要病原菌之一。人们误食了宋内氏志贺菌污染的食物，引起发热、腹痛、腹泻等症状，其所引起的肠道传染病，发病率居传染病之首。

检验方法包括样本采集、前增菌、标本混合及DNA制备、实时荧光定量PCR、对结果呈阳性的混合标本还需做进一步确认，包括增菌、分离培养、菌株鉴定、血清学检验、操作程序复杂，用到如PCR仪等多种昂贵仪器，检测价格昂贵。其中急性中毒型细菌性痢疾还会容易误诊，在出现大范围病原菌感染时，很难实现快速检测。传统检测宋内氏志贺菌的方法，费时、费力，已不能适应社会的快速发展。

核酸体外扩增技术是对传统检测方法的补充，相关技术被广泛应用于食源性致病菌检测。比如PCR，环介导等温扩增(loop-meditated isothermal amplification,LAMP)等。PCR需要精密的温控系统，样品纯度要求较高，不适用于现场检测。LAMP技术由日本学者Notomi发明，其关键在于根据病原菌特有基因的6个区域设计4～6条引物，通过链置换DNA聚合酶在恒温条件下即可完成核酸扩增。若基因有一个区域与特异性引物不匹配便不能进行扩增，具有极高的特异性。在一小时内仅需水浴锅便可扩增出100～1000拷贝目的基因，灵敏度比常规PCR高10～10000倍。LAMP因其特点被广泛的应用到病原微生物检测中。但LAMP反应体系相对复杂，多对引物的添加量、酶、缓冲液、MgSO4等体系成分，还有反应温度、时间等设置，如若任一种条件不是最佳的条件，都有可能出现非特异性条带，出现假阳性，干扰检测的准确度。

细菌及古细菌有一种获得性免疫防御机制，在21世纪初被正式命名为成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats,CRISPR)，它由CRISPR位点和编码CRISPR相关蛋白的编码基因组成。Ⅱ类Ⅴ型CRISPR效应蛋白Cas12a由著名学者张锋于2005年发现，CRISPR/Cas12a只需要在crRNA的引导下即可对靶DNA进行切割，与此同时Cas12a也与任意单链DNA结合并执行切割活动。这一现象被称作“附属切割(collateral cleavage)”。利用其附属切割活性使得Cas12a/crRNA/靶标DNA复合物切割荧光报告探针，从而使底物产生荧光信号，可开发出一种新的核酸检测系统。CRISPR/Cas12a系统在病原菌核酸检测以及核酸分子诊断领域应用十分广泛。但CRISPR/Cas12a系统的检测灵敏度受限，往往需要借助于核酸放大器(PCR、RPA、LAMP)等技术来弥补其自身检测系统的缺陷。但每种核酸放大器的检测灵敏度也存在差异，其中LAMP的检测灵敏度很高，但容易出现假阳性结果，经过Cas12a酶切的二次检测，可有效避免LAMP的假阳性结果，LAMP与CRISPR/Cas12a检测系统相结合，大大提高宋内氏志贺氏菌的检测灵敏度和特异性。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于LAMP结合CRISPR/Cas12a系统高效、快速、适用于现场的检测宋内氏志贺氏菌的新方法。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：