[发明专利]一种用于鉴定乙酸乙酯产生菌株的简并引物及其应用

说明书

本发明公开了一种用于鉴定乙酸乙酯产生菌株的简并引物及其应用，属于分子生物学领域。本发明分别基于乙酸乙酯合成的功能基因ATF1和EAT1编码的醇酰基转移酶设计了6对简并引物对，通过比较各引物对检测有效性、准确性、灵敏度，筛选了2对具有显著优异效果的简并引物对。通过多重PCR技术，快速检测酵母和检测样品是否具有产乙酸乙酯的潜力，并且可以判断检测样品中负责乙酸乙酯合成的基因类别。

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定乙酸乙酯产生菌株的简并引物及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

乙酸乙酯作为浓香型白酒“四大酯”之一，它与己酸乙酯的量比对浓香型白酒的典型风味呈现具有重要的作用。近年来，由于酿造过程中出现乙酸乙酯偏高的现象，甚至超出己酸乙酯的含量，导致酒体协调性、典型性降低，制约了浓香型白酒品质的提升。浓香型白酒发酵中有多种酵母共同参与，如Pichia,Candida,Saccharomyces等。这些酵母具有较强的产酯及其它风味化合物的能力，如乙酸乙酯、异戊酸乙酯、异戊醇、苯乙醇等，对白酒风味具有重要影响。因此，快速识别传统酿造过程中乙酸乙酯产生菌株，实现乙酸乙酯含量的源头控制是亟需解决的问题。

酵母主要通过醇酰基转移酶的转移作用将乙酰辅酶A的酰基转移给乙醇，从而生成乙酸乙酯。在酵母中，编码醇酰基转移酶的基因主要有ATF1和EAT1。基因ATF1和EAT1编码的醇酰基转移酶分别在酵母细胞的细胞质基质和线粒体中，并且它们合成乙酸乙酯的能力差异较大。由于该编码基因在不同酵母中呈现多样化，并且同一酵母中的ATF1和EAT1基因序列差异很大，导致到目前为止还没有一种引物能够同时检测不同酵母的ATF1或EAT1基因。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过对6对简并引物的扩增性能的比较，提供了一种用于产乙酸乙酯酵母快速检测的引物及其应用。

本发明的第一个目的是提供了鉴定或辅助鉴定乙酸乙酯产生菌株的简并引物对，所述简并引物对包括针对基因ATF1的简并引物对A和/或针对基因EAT1的简并引物对B；所述简并引物对A由核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段组成，所述简并引物对B由核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸片段组成。

本发明的第二个目的是提供鉴定或辅助鉴定乙酸乙酯产生菌株的试剂盒，所述试剂盒包含所述简并引物对。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中还含有PCR反应缓冲液。

本发明的第三个目的是提供所述简并引物对或所述试剂盒在筛选或检测乙酸乙酯产生菌株的方法，所述方法的具体步骤如下：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以步骤(1)待测样本DNA为模板，利用所述简并引物对进行PCR扩增；

(3)根据PCR扩增产物的大小确定待测样本中是否含有乙酸乙酯产生菌株。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，PCR扩增的退火条件为48～52℃退火55～65s。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，简并引物对A的PCR扩增条件为95℃3min；95℃30s；52℃1min；72℃1min；30个循环，简并引物对B的PCR扩增条件为95℃3min；95℃30s；50℃1min；72℃1min；30个循环；简并引物对A和B的多重PCR扩增条件为95℃3min；95℃30s；48℃1min；72℃1min；30个循环。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系为1μl的待测样本DNA，12.5μl的2×Taq PCR MasterMix(with loading dye)，正向引物1μl，反向引物1μl，去离子水补足25μl。