[发明专利]一种鉴别井冈蜜柚苗木品种的引物组、试剂盒及鉴别方法

说明书

本发明一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法，涉及分子标记技术领域。本发明基于全基因组重测序结果，开发了多态性良好的InDel标记引物，引物使用其中任意1对便可将2个主栽品种在早期进行区别，检出率为92.31‑100％，检测准确率为100％，为井冈蜜柚品种早期精准鉴别提供了依据，为生产上澄清品种名称发挥了积极作用。

本发明为专利：一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法的分案申请，原申请的申请日为：2022年02月22日，申请号为：202210163279.X，专利名称为：一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法。

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种鉴别井冈蜜柚苗木品种的引物组、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

井冈蜜柚是指以“井冈山”为品牌，在江西省吉安市生产栽培的甜柚品种的统称，为我国地理标志性农产品，是吉安重点支持发展的六大富民产业之一，也是江西省果业三大金字招牌之一。到目前为止，井冈蜜柚种植面积已达40余万亩，有3个主栽品种，分别为金沙柚、金兰柚和桃溪蜜柚，据统计，截至2020年年底，前两个品种种植面积达井冈蜜柚总面积的71.27％，是主导品种，桃溪蜜柚种植面积占13.39％。桃溪蜜柚是沙田柚在江西的变种，其成熟期早且果实特征显著，易与其他两个井冈蜜柚品种鉴别。但是，因为金沙柚是金兰柚和沙田柚的杂交后代，这两个井冈蜜柚品种亲缘关系很近，仅凭形态特征很难区别。在井冈蜜柚快速发展的过程中，金兰柚和金沙柚2个主栽品种被混淆，导致生产上苗木混乱，品种名称错用，严重影响了该产业的健康可持续发展。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法，可将2个主栽品种有效区别，为井冈蜜柚品种早期精准鉴别提供了依据，为生产上澄清品种名称发挥了积极作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物，所述引物组包括PA1、PA2、PA3、PA4、PA5、PA6、PA7和PA8中任意1对或多对的组合；各引物的序列如表1所示：

表1引物组的序列

本发明基于全基因组重测序结果，开发上述8条多态性良好的InDel标记引物，这8对引物使用任意1对便可将2个主栽品种区别开，为井冈蜜柚品种早期精准鉴别提供了依据，为生产上澄清品种名称发挥了积极作用。本发明所述井冈蜜柚栽培种优选包括金兰柚柚和金沙柚，其中金沙柚是金兰柚(母本)和沙田柚(父本)的杂交后代，金沙柚为子代。

本发明对所述引物组的获取方法并没有特殊限定，优选取幼嫩叶片置于液氮中研磨后提取基因组总DNA，获得的原始数据经过FastQC进行质量评估，利用Fastp软件去除接头序列和进行数据质控，以晚白柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Wanbai)(website：http://citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php)为参考基因组建立索引，运用BWA软件将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对，通过GATK进行InDel检测和过滤。利用严格的参数进行InDel标记筛选(Simona et al.，2017)：(1)变异位点的QUAL大于400；(2)变异位点的GQ值为99；(3)覆盖深度大于20；(4)InDel插入或者缺失的长度在5-8bp之间。根据参考基因组注释筛选出变异位置侧翼序列信息，利用Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)设计InDel标记的扩增引物。然后使用e-PCR进行引物特异性检测，最终选择8对具有特异性的InDel标记扩增引物。

本发明还提供了一种包含上述引物组的鉴定井冈蜜柚栽培种类型的试剂盒。

本发明所述试剂盒优选还包括PCR反应试剂，如Mix液和/或ddH₂O。