[发明专利]一种用于猪耳组织成纤维细胞培养的样品采集方法

说明书

本发明公开了一种用于猪耳组织成纤维细胞培养的样品采集方法，该方法包括场内操作、场外操作及实验室预操作，场内操作为先用温水将猪耳部血管较少的耳边缘擦洗干净，用生理盐水冲洗擦多次，再用酒精棉球擦拭多次，剪下小块猪耳组织放入含双抗的生理盐水中送出场区。场外操作为将场内操作处理过的小块猪耳组织放入酒精中，旋涡震荡，用生理盐水冲洗，将猪耳组织放入含双抗的DMEM培养液中，低温送回实验室。实验室预操作为将场外操作处理过的猪耳组织放入酒精中，旋涡震荡，用超纯水冲去酒精，用HBSS培养液清洗后刮去毛发和表皮，剪小后即可组织块培养。本发明中猪耳组织样品采集方法用时短，污染率低，过程可操作性强，试验结果可控性强。

技术领域

本发明涉及一种用于猪耳组织成纤维细胞培养的样品采集方法，属于生物技术领域。

背景技术

畜禽遗传资源保存的方法主要有活体动态保存和静态保种，其中静态保种包括体细胞、卵子、精子、胚胎的超低温冷冻保存和DNA文库保存。体细胞冷冻保存因其方法成熟，效率高，可操作性强，且样品采集时对动物影响较小，故比胚胎冷冻保存等方法更为便捷。随着细胞体外培养技术的成熟，细胞可以在体外维持生命活动正常有序进行。有研究报道，采用猪的颗粒细胞、皮肤成纤维细胞作为供体，均已成功获得克隆猪。猪耳组织成纤维细胞，获取方式简单，培养容易，增殖快速，可以有效保存个体全部遗传信息，在此基础上可以进一步构建地方猪种的成纤维细胞库。通过耳组织采样、体细胞建系和冷冻保存，再借助动物体细胞克隆技术，可实现地方猪种种质资源的长期保存。

现有猪耳组织采样的技术主要有：(1)将猪只保定，用75％酒精棉球擦拭猪耳采样部位，用U型剪耳钳剪取1-2块耳组织，在75％酒精中迅速刷洗20-30s。放入含双抗的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中简单清洗以除去残余酒精，最后装入内含双抗PBS的离心管中，放入装有冰袋的泡沫盒，离心管不接触泡沫盒内壁，低温运输。该方法主要针对小猪使用，如果是大猪或成年公猪或成年母猪，该方法过于简单，不能有效去除病原菌，在细胞培养过程中容易受到污染。(2)温水将猪耳朵冲洗干净，刮毛刀刮毛；生理盐水冲洗，双氧水反复消毒直到不起泡沫为止，再用生理盐水冲洗；碘伏棉球擦拭3遍，酒精棉球擦拭3遍；止血钳夹住要采集的部位下缘，剪刀剪取消毒部位3cm²。剪取部位放入组织消毒液(医用生理盐水与医用碘伏1:1体积比混合)中浸泡2min；用镊子从管内夹出组织用生理盐水冲洗，放入组织保存液(医用生理盐水500mL添加青霉素25万IU、链霉素0.25g)后封口，放入4℃度冰袋的泡沫箱内，12h内低温运回实验室。该方法在场内的操作时间比较长，操作程序比较多；刮毛和双氧水反复消毒主要目的是去除病原菌，减少病原菌的污染，但在没有专门的技术培训下可能存在消毒不彻底。(3)用火焰灼烧家畜耳缘，去除表层毛发；用手术刀刮去耳朵灼烧部位的毛根和角质层，暴露出真皮层；用酒精棉擦洗、消毒暴露出的真皮层部位，擦洗3次；用灭菌超纯水冲洗该部位；用手术剪剪取冲洗好部位的耳组织；再次用灭菌超纯水冲洗后放入培养液(含3％-5％双抗)离心管中；用封口膜封闭管口，做好记录后放入冰盒保存；对组织剪取部位进行消毒止血。该方法在场内操作比较麻烦，需要对猪的耳组织进行灼烧，猪的应激很大，猪的保定工作很重要，要注意人猪安全，因此采样时间很长。

但随着非洲猪瘟疫情的爆发，非洲猪瘟疫情防控成为常态化，实验人员不能进入猪场采样，实验器材进入猪场的程序非常繁琐，采样工作完全交由场内技术人员负责，样品采集本身需要按规范进行操作，但如果某一环节出现问题，样品极容易受到污染，导致耳组织成纤维细胞培养失败。因此，需要开发出一种可以短时间内进行采样，保证样品尽可能不受到污染的采样方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种用时短、污染率低的用于猪耳组织成纤维细胞培养的样品采集方法。

技术方案：一种用于猪耳组织成纤维细胞培养的样品采集方法，包括以下步骤：

(1)场内操作：在猪场生产区内用温水将猪耳部血管较少的边缘擦洗干净，用生理盐水冲洗擦洗过的猪耳边缘多次，再用酒精棉球擦拭多次，剪下小块猪耳组织放入含双抗的生理盐水中送出场区；