[发明专利]猪FAPs永生化细胞的构建方法及用途

权利要求书

1.一种猪FAPs永生化细胞的构建方法，其特征是：包括以下步骤：

1）猪 FAPs细胞的分离培养：将3日龄仔猪麻醉后，体表用酒精擦拭、消毒，随后在无菌超净台中取背最长肌，充分剪碎组织后按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶 Ⅰ ；在 37 ℃ 消化1 h后，依次经70 μm和40 μm的滤网过滤，离心后收集细胞；随后经磁珠分选方法分离PDGFRα阳性细胞，即FAPs细胞，接种于12孔板培养；

2）转染过表达SV40T的慢病毒：待细胞生长至40%左右，加入慢病毒，感染72 h后观察荧光，检测转染效率；

3）抗生素筛选成功转入SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞：待感染SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞生长至90%时，根据慢病毒本身的抗性基因，利用嘌呤霉素筛选转入SV40T慢病毒的猪FAPs细胞；得到猪 FAPs永生化细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤4）验证猪 FAPs永生化细胞的永生化能力：经嘌呤霉素筛选纯化得到的SV40T阳性的猪 FAPs细胞记为第1代P1，待细胞生长至80%～85%时传代，在P5、P10、P15、P20、P25、P30代时进行增殖和成脂分化能力检测；猪 FAPs细胞传代至第30代时仍具有增殖和成脂能力。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤5）诱导FAPs 细胞成纤维分化：用含5%FBS的DMEM培养基+10ng/Ml TGFβ1重组蛋白，处理48h；成脂分化：MDI medium包含IBMX 500μM、胰岛素10 μg/mL、罗格列酮2 μg/mL和地塞米松1 μM；INS medium包含胰岛素10 μg/mL。

4.一种根据权利要求1所述的构建方法得到的猪 FAPs 细胞的用途，其特征是：

1）为FAPs细胞相关研究提供了可靠细胞模型，满足动物福利要求；或者

2）用于研究猪肌内脂肪的形成调控及其分子机制；或者

3）用于研究FAPs细胞成脂/成纤维分化的命运决定机制；或者

4）用于研究猪 FAPs 细胞成脂/成纤维分化过程中代谢规律以及基因功能；或者

5）用于筛选靶向促进FAPs细胞增殖或成脂分化的营养素、生物活性因子，为细胞培养肉的研发提供稳定模型。

5. 根据权利要求4所述的用途，其特征是：所述的猪 FAPs 细胞的感染复数（Multiplicity of infection, MOI）为30，添加的助转剂polybrene的浓度为4μg/mL。

6. 根据权利要求4所述的用途，其特征是：所述的猪 FAPs 细胞在3D凝胶培养体系，并形成细胞球，用于细胞培养肉生产，或者用于筛选靶向促进FAPs细胞增殖或成脂分化的营养素、生物活性因子，为细胞培养肉的研发提供稳定模型。