[发明专利]猪FAPs永生化细胞的构建方法及用途

说明书

本发明公开了一种猪FAPs永生化细胞的构建方法及用途。构建方法，包括以下步骤：1）猪FAPs细胞的分离培养；2）转染过表达SV40T的慢病毒；3）抗生素筛选成功转入SV40T慢病毒的猪FAPs细胞。进一步，4）验证猪FAPs永生化细胞的永生化能力；5）建立猪FAPs细胞成纤维分化诱导方法；6）猪FAPs细胞3D培养模型建立。本发明：1）解决了当下猪FAPs细胞来源的局限，减少了动物牺牲数量，为FAPs细胞相关研究提供了可靠模型；2）可用于研究猪肌内脂肪的形成调控及其分子机制；3）还可用于研究FAPs细胞成脂/成纤维分化的命运决定机制；4）还可用于筛选靶向促进FAPs细胞增殖或成脂分化的营养素、生物活性因子等，为细胞培养肉的研发提供可靠的模型。

技术领域

本发明涉及一种猪永生化成纤维/成脂祖细胞 (fibro-adipogenicprogenitors, FAPs) 的建立方法及用途，属于现代农业和食品研究领域的应用技术。

背景技术

沉积在骨骼肌中的肌内脂肪（Intramuscular Fat, IMF）又称为风味脂肪，其含量与猪肉的感官、食用品质密切相关，直接影响肉的风味、多汁性、嫩度、色泽等多个指标。猪肉的理想IMF含量在 2.5%～3.0%，IMF含量低会严重影响肉的风味和口感，降低肉品质。前期研究发现，IMF细胞是由多种来源的干细胞或祖细胞分化而来，包括侧群细胞、周细胞、多能间充质干细胞、肌卫星细胞及FAPs等，其中FAPs是小鼠和人肌肉再生过程中脂肪化的主要细胞来源，FAPs 特异性表达 PDGFRα和 Sca-1。近期研究同样发现，FAPs是猪肌内脂肪形成的重要细胞来源。因此，如何在不影响猪肉产量的前提下适当提高猪肉中IMF含量，是改善猪肉品质的关键策略。另一方面，从人类健康的角度来看，IMF沉积与衰老、骨骼肌功能异常、糖尿病及其他慢性代谢病密切相关，而猪的生理结构和解剖特性与人类极为相似，被研究者认为是一种接近人类的动物模型。因此，了解猪FAPs的分化、成熟机制等过程，同样为治疗人类疾病提供新的方案。

就目前来看，猪FAPs相关研究处于起步阶段：没有猪FAPs的相关研究报道；没有成熟的分离纯化方法；只是简单用肌肉消化后的混合细胞研究肌内脂肪细胞分化聚酯，没考虑纯化FAPs等。目前获得猪FAPs的方法是通过免疫磁珠或流式分选PDGFRa⁺细胞，这类方法不仅获取成本高（每次需要屠宰动物、获取肌肉组织），并且原代FAPs细胞在体外培养几代之后，培养效率显著下降。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种猪 FAPs 永生化细胞的构建方法及用途。

猪 FAPs永生化细胞的构建方法及用途，包括以下步骤：

1）猪 FAPs细胞的分离培养：将3日龄仔猪麻醉后，将其体表用酒精擦拭、消毒，随后在无菌超净台中取背最长肌，充分剪碎组织后按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶Ⅰ；在 37 ℃消化1 h后，依次经70 μm和40 μm的滤网过滤，离心后收集细胞；随后经磁珠分选方法分离PDGFRα阳性细胞（即FAPs细胞），接种于12孔板培养；

2）转染过表达SV40T的慢病毒：待细胞生长至40%左右，加入慢病毒，感染72 h后观察荧光，检测转染效率；

3）抗生素筛选成功转入SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞：待感染SV40T慢病毒的猪FAPs细胞生长至90%时，根据慢病毒本身的抗性基因，利用嘌呤霉素筛选转入SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞；

4）验证猪 FAPs永生化细胞的永生化能力：经嘌呤霉素筛选纯化得到的SV40T阳性的猪 FAPs细胞记为第1代（P1），待细胞生长至80%～85%时传代，在P5、P10、P15、P20、P25、P30代时进行增殖（KI67染色）和成脂分化能力（尼罗红染色）检测。