[发明专利]一种铁皮石斛茎腐病组培苗抗性鉴定方法

说明书

本发明涉及抗茎腐病铁皮石斛种质鉴定技术，本发明铁皮石斛茎腐病组培苗抗性鉴定的方法，包括如下步骤：（1）病害部位的子实体分离纯化培养，病原菌分子鉴定；（2）配制组培苗培养基，转入组培苗培养；（3）配制接种菌液液体培养基，制备1×10⁶个/mL的孢子悬浮液；（4）无菌棉签头蘸取孢子悬浮液，紧贴铁皮石斛组培苗放到培养基上接种；（5）接种后进行病情调查，依据病情指数评价铁皮石斛种质资源抗病性。本发明弥补了铁皮石斛种质抗病性鉴定技术的空白，提供一种操作简单、准确、快速的铁皮石斛茎腐病组培苗抗性鉴定方法。

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛茎腐病组培苗抗性鉴定方法，属于植物病理学研究技术领域。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属植物，是我国重要的药用植物，具有“养阴生津、润喉护嗓、温胃明目、补肾益力、延年益寿”等功效，道家医学经典《道藏》把铁皮石斛称为九大仙草之首，被列入《中华人民共和国药典》（2020版），也具有重要的观赏价值。随着组培技术的快速发展和栽培水平不断提高，人工种植的铁皮石斛种植面积不断增加，铁皮石斛茎腐病成为了主要的病害，其主要在夏季、秋季两季高温高湿的环境中发生，具有较明显的发病中心，叶片呈水渍状，假鳞茎软化枯萎，假鳞茎基部可见淡黄色霉状物，发病严重时，叶片全部失绿或脱落，整株失绿枯萎。铁皮石斛茎腐病主要采用化学药剂防治，不同铁皮石斛品种对于茎腐病的抗病和感病程度不同，利用抗病品种防治铁皮石斛茎腐病也是一种重要的防治手段，抗病品种的选育和利用离不开铁皮石斛茎腐病病害抗性鉴定。目前常用的植物抗病鉴定方法是种子侵染接种、幼苗期喷雾接种、灌根接种、离体叶片接种等，尚未见到铁皮石斛茎腐病抗性鉴定的方法，严重制约了铁皮石斛茎腐病抗病性品种的选育，因此，探索一种操作简单、准确、快速的铁皮石斛茎腐病组培苗抗性鉴定方法，采用科学有效的方法评价和鉴定不同铁皮石斛品种的抗病性，为筛选抗病铁皮石斛种质资源和新品种提供科学方法。

发明内容

本发明根据上述领域存在的空白和技术需求，提供一种操作简单、准确、快速的铁皮石斛茎腐病组培苗抗性鉴定方法。

本发明是以如下技术方案实现的，一种铁皮石斛茎腐病组培苗抗性鉴定方法，按如下步骤进行：

（1）病原菌分离与鉴定：观察并用无菌解剖针挑取铁皮石斛茎腐病病害部位的子实体，用无菌的滤纸吸干其表面水分，将子实体移至PDA培养基上，25℃避光培养，再将培养物进行划线纯化培养，即可获得纯培养铁皮石斛茎腐病病原菌菌株，提取菌株的DNA进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，PCR产物进行测序，测得序列向NCBI数据库提交并进行DNA序列对比，铁皮石斛茎腐病病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，铁皮石斛茎腐病病害部位的子实体为尖孢镰刀菌无性阶段的分生孢子座。

（2）组培苗及培养基的准备：优选组培苗培养基，挑选不同铁皮石斛种质资源生根壮苗培养后生长一致的组培苗，转入盛有组培苗培养基的650ml组培瓶中，每瓶接3株，9h光照15h黑暗25℃培养15d。

（3）接种菌液的培养及配制：优选接种菌液液体培养基，将铁皮石斛茎腐病病原菌菌株转接至PDA培养基上25℃恒温避光培养7d，用打孔器在菌落边缘打取菌饼，挑取3个菌饼放置于装有接种菌液液体培养基的锥形瓶中，于12h光照12h黑暗，25℃恒温，130r/min振荡培养3d，用4层纱布过滤得到分生孢子滤液，加入无菌水稀释并采用血球计数板调整孢子浓度，得到浓度为1×10⁶个/mL的孢子悬浮液。

（4）接种：剪下无菌棉签的棉签头，蘸取孢子悬浮液，然后将棉签头紧贴铁皮石斛组培苗放到培养基上，每份铁皮石斛种质资源接种5瓶，3次重复，棉签头蘸取无菌水的铁皮石斛组培苗为对照，9h光照15h黑暗25℃培养。