[发明专利]一种基于全自动数字PCR一体机的单细胞检测方法

权利要求书

1.一种单细胞检测的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于：

步骤一：制备单细胞分离体系；

所述单细胞分离体系包括经荧光染色的待测细胞、扩增原料、引物、探针和Taq酶；

当待测细胞含有两种或两种以上类型的细胞时，步骤一中对其中至少一种细胞单独染色，使其可以在明场或荧光场下与其他类型的细胞区分和单独计数；

步骤二：使用全自动数字PCR一体机，将所述单细胞分离体系分散成至多包含一个细胞的微液滴，并使微液滴平铺在数字PCR检测板上；

步骤二中，使用所述全自动数字PCR一体机的控制程序，设定所述微液滴体积为0.3nL至1.5 nL之间的数值；

步骤三：在明场和荧光场观察，对包裹有细胞的微液滴计数；

当步骤三中未发现单独荧光染色的细胞时，停止该数字PCR检测板的检测；

步骤四：热裂解细胞，在荧光场下观察微液滴，对仍能够观察到存在细胞形态的微液滴进行即时计数，并计算细胞裂解率，直至细胞裂解率达到预设值，细胞裂解率=(步骤三中包括有细胞的微液滴数-仍具细胞形态的微液滴数)/步骤三中包括有细胞的微液滴数；

步骤五：升温至95℃保持10-20分钟以启动Taq酶，并降温退火，完成第一次扩增，循环进行预定次数的扩增，统计高亮微液滴数；

对最终测定结果进行数值修正，修正的最终测定结果=高亮微液滴数÷裂解率。

2. 如权利要求1所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：步骤二中，使用所述全自动数字PCR一体机的控制程序，设定所述微液滴体积为0.6nL至1.0 nL的数值。

3.如权利要求1所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：步骤二中观察发现微液滴有重叠时，加热到60℃使其平铺。

4.如权利要求1所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：在步骤三、步骤四和步骤五中，采用自动计数方案。

5.如权利要求1所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：所述单独染色是指，仅对待测细胞中的一种细胞进行荧光染色，或者使某种待测细胞与其他待测细胞的荧光染色颜色不同。

6.如权利要求1所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：当待测细胞含有两种或两种以上类型的细胞时，所述单细胞分离体系含有的引物和对应的探针能够检测特定位点，所述特定位点是待测细胞中的一种所特有的。

7.如权利要求6所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：所述单细胞分离体系包含检测不同位点的引物和探针，对应不同位点的多种探针的发光颜色不同。